¿Variación de pocillo a pocillo en la fluorescencia del termociclador?

Tenemos un viejo termociclador BioRad ICycler con detector fluorescente de un solo color MyIQ. Si bien está diseñado para RT-PCR, lo hemos estado usando para curvas de fusión y ensayos de unión para diferentes tipos de ARN usando naranja de tiazol como fluoróforo intercalado. Sin embargo, cuando tratamos de tomarnos en serio este ensayo y hacer las cosas por triplicado, notamos que la variación entre pozos era terrible, lo que dificultaba obtener la significación estadística.

Después de leer el manual, traté de obtener "factores de pozo persistentes" para que el instrumento corrigiera esta variación. Sin embargo, el protocolo del instrumento para esto requiere calentar a 95⁰C, por lo que los fluoróforos intercalados no funcionarán, el ARN se derrite y se pierde la fluorescencia, así que probé con fluoresceína. Esto no resolvió la variación.

Así que traté de hacer mis propios factores de pozo haciendo 10 mL de solución de ARN Poly(rA) Poly(rU) con naranja de tiazol y llenando 96 tubos PCR con 100 µL cada uno y midiendo la fluorescencia. Luego calculo la fluorescencia promedio y divido el promedio por el valor de cada pocillo para determinar un factor, F, para cada pocillo. Luego traté de normalizar los experimentos posteriores multiplicando la fluorescencia de cada pocillo por su F para obtener un valor corregido. Sin embargo, aunque esto reduce un poco la variación, sigue siendo bastante malo.

¿Tiene alguna sugerencia para reducir la variación de pozo a pozo en estos experimentos o corregir los datos de otra manera?

No tengo experiencia previa con instrumentos de RT-PCR, todo lo que sé proviene de jugar con el instrumento. No sé si me estoy perdiendo algo realmente básico.

Protocolo paso a paso

1. Tampón 1xSSC preparado, NaCl 150 mM, citrato de sodio 15 mM, pH 7,5
2. Se pesaron 5 mg de naranja de tiazol, disueltos en 1 ml de metanol
3. Naranja tiazol diluida 1000 veces en 1xSSC
4. Tomó 71,4 µL (100 µg) de solución de poli(rU) poli(rA), 1,4 µg/uL
5. ARN diluido con 8,93 ml 1xSSC
6. Se agregaron 100 µl de naranja de tiazol diluido al ARN diluido, volumen final de 10 ml
7. Configure 96 tubos de PCR, use una pipeta de 8 canales y un canal para transferir 100 µL de solución de ARN a cada uno.
8. Tubos de PCR colocados en las 96 posiciones del termociclador
9. Ejecutó el protocolo de curva de fusión, comience a 25 ⁰C, aumente 1 ⁰C en cada ciclo, 60 ciclos, por lo que la temperatura final es de 85 ⁰C. Cada ciclo es de 10 segundos. Mida la fluorescencia en cada ciclo.
10. Curva de fusión repetida 3 veces, total de 4 curvas.
11. Ponga los datos de cada curva en la hoja de cálculo. 96 puntos de datos en cada temperatura.
12. Fluorescencia promediada en toda la placa a cada temperatura. Usó estos valores promedio, desviación estándar, máximo y mínimo para hacer los diagramas a continuación.
13. Factores de corrección calculados para cada pocillo a cada temperatura dividiendo la fluorescencia media de toda la placa por la fluorescencia de cada pocillo para las curvas de fusión 2, 3 y 4. Factores de corrección promediados de cada curva.
14. Fluorescencia corregida calculada para las curvas 1, 2, 3 y 4 multiplicando el factor de corrección promediado para cada pozo por la fluorescencia observada para ese pozo.
15. Se volvieron a representar los valores corregidos para mostrar una variación reducida.

Los datos se muestran a continuación. Repetí la curva de fusión 4 veces porque la primera fusión generalmente tiene una intensidad más baja que las fusiones posteriores. El eje Y es la fluorescencia, el eje X es la temperatura en grados Celsius, y tracé la fluorescencia promedio en cada temperatura con la desviación estándar junto con el mínimo y el máximo para mostrar qué tan fuera de la desviación estándar están cayendo algunos pozos. Calculé los factores de corrección para las curvas de fusión 2, 3 y 4 y los promedié. Cuando utilicé estos factores promediados en las curvas de fusión 2, 3 y 4, hizo un buen trabajo eliminando la variación. Cuando apliqué los factores de corrección a la curva de fusión 1, redujo la variación, pero no mucho.