¿Cuánto tiempo puedo almacenar el ARN extraído?

Si extraigo ARN de una muestra (tejido de hoja) mediante una extracción de fenol:cloroformo de un solo paso, ¿cuánto tiempo se pueden almacenar esas muestras a -80 °C? ¿Y cuántas veces puedo descongelarlos y volverlos a congelar antes de que se degraden?

Supongo que esto dependerá en gran medida de la purificación de la muestra, el ARN puro (sin Mg2+, por ejemplo) se puede almacenar durante mucho tiempo a temperaturas más bajas. El ARN puro en agua puede permanecer estable durante meses a 4 °C. La congelación y descongelación del ARN puede afectar el plegamiento (para el ARN con una estructura terciaria importante) como he observado.
Si le preocupan los ciclos de congelación/descongelación, alícuotas en varios tubos, de esa manera solo descongela lo que necesita usar.

Respuestas (3)

Descubrí que el ARN extraído utilizando kits comerciales se ha mantenido estable durante muchos años a -80 C. Sin duda, lo haría en alícuotas antes de congelarlo, ya que el ARN es particularmente sensible a la escisión por congelación y descongelación.

De hecho, hemos verificado la degradación de los extractos de ARN viral y, en su mayor parte, se mantendrán durante más de un año a -80. Sin embargo, vimos más variación de estabilidad correlacionada con la secuencia de lo que esperábamos.
Esto es interesante: ¿cómo midió la degradación? Me imagino que la degradación que podría tener un efecto significativo en, por ejemplo, RNASeq, no se mostraría en un gel.

Podemos mantener el ARN extraído a -80 °C durante algunas semanas, pero antes de comenzar cualquier experimento, debe validarse mediante electroforesis en gel.

Mantengo mi ARN en citrato de sodio 1 mM, pH 6,4. El citrato es un quelante y ayuda a atrapar los metales divalentes que muchas ARNasas necesitan para funcionar. El pH más bajo también ayuda a inhibir la actividad de la ARNasa. El EDTA podría funcionar como quelante, pero solo se quela bien a pH donde la actividad de la ARNasa es peor. El citrato proporciona quelación y pH bajo.

Por supuesto, también mantengo mi ARN en -80.

¿Necesita hacer algo especial para eliminar el citrato cuando llega el momento de usar el ARN, por ejemplo, para hacer ADNc?
Nunca he notado ningún problema, pero nunca lo he comprobado. Solo he estado trabajando con ARN durante un par de meses y mi laboratorio está en un edificio antiguo con mucho polvo, por lo que la contaminación de ARNasa ha sido un problema mayor que la actividad enzimática. Una precipitación con isopropanol debería ser suficiente para limpiar el ARN antes de cualquier reacción si el citrato resulta ser un problema.
También estamos en un edificio viejo y polvoriento, y la RNasa también es un problema para nosotros. Gracias por el consejo: comprobaré si funciona para fines de RNAseq.
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