¿Cómo extraer ARN y realizar RT-qPCR de muy pocas células (~5000)?

Actualmente estoy realizando un experimento que involucra la clasificación FACS de una población específica de células usando un anticuerpo de interés.

Para validar el tipo de células que he recolectado usando este marcador, quiero realizar qPCR en su ARN extraído, usando ciertos cebadores de marcadores de tipo celular conocidos.

Mi problema es que en cada sesión de clasificación, solo puedo recolectar entre 5,000 y 10,000 celdas. ¿Sabe si es posible realizar RT-qPCR en una muestra tan pequeña?

He recogido las células en 1mL de Trizol.

¿Tal vez tendría que amplificar el ADNc después de la transcripción inversa de manera general (usando cebadores aleatorios)?

Gracias por tu ayuda.

No estaría de más intentarlo. Con los cebadores correctos y suficientes ciclos de PCR, debería poder amplificar casi cualquier cosa, aunque tal vez no perfectamente.
Creo que esto debería ser posible, aunque no obtendrá mucho cDNA, por lo que probablemente solo tenga una oportunidad. Además de esto: ¿Por qué usa tanto Trizol? Por lo general, usé 1 ml para un pocillo de una placa de seis pocillos, que tiene muchas más células. Cuando precipites, asegúrate de estar usando algún agente de coprecipitación como glucógeno, para que no pierdas la muestra. Y probablemente no verá el sedimento de ARN con tan pocas células.
Gracias Chris. ¿Cuánto Trizol recomendaría? Estoy usando 1 ml porque clasifico en tubos de 1,5 Epp y trato de evitar que las células se adhieran a las paredes del tubo cuando salen del clasificador. ¿Tendría sentido amplificar todo el ADNc después de la RT? (¿Amplificación de cebador no específica, solo aleatoria?)
¿No vas a amplificar el cDNA en tu qPCR de todos modos? Una preamplificación probablemente causaría problemas con sus datos.
No preamplificaría el ADN, ya que esto puede traer muchos problemas al sesgar las proporciones entre los ARN. Incluso si sus células se adhieren a la pared del tubo, si agita el tubo en un vórtice, las células se lisarán. A ver que cantidad de Trizol se recomienda para que numero de celular, si no recuerdo mal, hay una parte en el manual. Además de no necesitar tanto Trizol, también ahorrará dinero y producirá menos residuos nocivos.
1 ml de trizol es bastante. Lo uso para ~ 1 millón de células (un pocillo de una placa de 12 pocillos para HeLa. Por lo general, necesitas la mitad de eso). También puede probar uno de los kits de extracción de ARN. Agregue ADNasa-I para eliminar cualquier rastro de ADN. No haga una amplificación de cebador al azar. echa un vistazo aquí

Respuestas (2)

Puede considerar el uso de kits de RT-qPCR de una sola célula como este si tiene el presupuesto para ellos. (Nota: personalmente no he usado este kit, solo expuse una idea)

El kit Ambion® Single Cell-to-CT™ contiene un flujo de trabajo completamente validado para el análisis de la expresión génica de muestras que contienen de 1 a 10 células. Cada kit contiene reactivos para preparación de muestras, transcripción inversa, preamplificación y qPCR que se han optimizado juntos en un flujo de trabajo simple que se puede completar en solo 5 pasos (ver figura).

Con una buena técnica, puede realizar de manera confiable RT-PCR o RT-qPCR en un tamaño de muestra de aproximadamente 100 células. Algunos de los comentarios son correctos en el sentido de que deberá compensar la reducción de la entrada inicial de células con ciclos de PCR adicionales. Sin embargo, cada magnitud en la reducción de células corresponde a aproximadamente 3 ciclos de PCR adicionales (2^3 = 8 ~= 10), por lo que el número total de ciclos de qPCR no cambiará significativamente.

Dado que está tratando con una pequeña cantidad de células y aislando con TRIzol, el sedimento puede ser difícil de ver. Le sugiero que use algo como Glycogen ( Glycoblue de Ambion ) para coprecipitar el gránulo en algo más visible. Agregaría esto antes del isopropanol para precipitar sus ácidos nucleicos.

Su uso de TRIzol extra no es un problema a menos que su laboratorio esté corto de dinero. Diluirá su concentración de ácido nucleico, lo que dificultará la precipitación, pero el uso de glucógeno lo compensará. El uso de una cantidad inferior a las proporciones indicadas manualmente puede ser problemático, ya que podría provocar una lisis incompleta y una desnaturalización de los componentes celulares.

Como recomienda user137, la preamplificación de los productos no es una buena idea, ya que probablemente distorsionará los resultados finales. No estoy seguro de qué expresiones génicas está viendo, pero siempre es una buena idea incluir varios genes domésticos como referencia para calcular los números de expresión relativos, siempre que tenga suficiente aislado de ARN para usar como entrada.

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