¿Cómo limpio el ARN contaminado con fenol sin perder nada de la muestra?

Recientemente extraje ARN de hojas de plantas en desarrollo por primera vez, como parte de un experimento muy largo e intensivo. Las muestras fueron extremadamente valiosas debido a la cantidad de esfuerzo que se dedicó a obtenerlas (cosechar miles de hojas minúsculas, una de cada planta, para obtener la masa requerida).

Extraje el ARN con TRIzol y cloroformo. Nanodrop mostró un rendimiento excelente, como cabría esperar de un tejido joven en crecimiento activo, pero algunas de las muestras tenían proporciones realmente bajas de 260/230. Sé que esto sugiere contaminación con fenol o sal, pero ¿qué puedo hacer para limpiar las muestras sin perder nada del preciado ARN? ¿Y cómo puedo evitar la contaminación en el futuro?

Respuestas (2)

Puede limpiar el fenol lavándolo con cloroformo y luego haciendo una precipitación con isopropanol seguida de un lavado con EtOH al 75 % (avíseme si desea un protocolo exacto).

Para evitar la contaminación (y la pérdida de muestras), debe ser meticuloso al pipetear (que mejorará con la práctica). Siempre puede usar esos tubos de bloqueo de fase que básicamente atascan un gel sólido entre las fases acuosa y orgánica, por lo que es mucho más fácil de pipetear.

¿Qué parte del pipeteo es la parte crucial? ¿Es la eliminación de la fase superior clara después de la centrifugación? Si es así, ¿la mayoría de la gente deja atrás un poco de la fase superior para evitar la contaminación? ¡Estaba tratando de obtener hasta la última gota!
@RichardSmith Sí, el pipeteo de la fase orgánica/acuosa es crucial. Depende de (1) lo bueno que sea pipeteando y (2) lo "preciosas" que sean sus muestras. Por supuesto, si es más meticuloso acerca de obtener la mayor cantidad de muestra posible, existe una compensación entre el rendimiento y la pureza. Si puedo dejar alguna muestra, generalmente dejo solo un poquito para evitar tocar la basura en la interfase entre las dos capas.
¡No debo ser tan bueno pipeteando como pensaba! Muchas gracias por tu respuesta. Me aseguraré de mejorar mi pipeteo y, mientras tanto, dejaré atrás una cantidad segura de la fase acuosa.
@RichardSmith Puede que no haya sido completamente culpa tuya. El procedimiento estándar es limpiar el ARN con isopropanol y etanol, lo cual parece que no hiciste. Una vez que haga eso, debería obtener un ARN súper limpio incluso si hubo un golpe en su pipeteo.
Limpié con isopropanol y etanol, y luego Nanodropped. ¡Asumo toda la responsabilidad!
@ jp89, por lo que entiendo, las limpiezas con IPA y etanol solo eliminan eficazmente las sales. La extracción de fenol cloroformo hace un trabajo mucho mejor con la eliminación de proteínas. Posiblemente podrías tomar algo de la interfase y limpiarla nuevamente. El fenol afectará sus columnas y afectará sus rendimientos.
También para deshacerse de todos los rastros de fenol, intente extraer con éter.

Una precipitación con etanol debería funcionar. Pero he tenido un gran éxito con las columnas de limpieza de ARN de Qiagen, que en mi opinión son más fáciles. Aquí hay una URL para ver las columnas de limpieza de ARN que ofrece Qiagen: http://www.qiagen.com/products/rnacleanupconcentration/default.aspx

También en el futuro debería considerar el uso de tubos PhaseLock:

http://www.5prime.com/products/nucleic-acid-purification/organic-nucleic-acid-extraction/phase-lock-gel-.aspx

Eso me salvó de tener su mismo problema muchas veces.

Muchas gracias por la respuesta y los enlaces. Tendré en cuenta los tubos PhaseLock: lo tomo con PhaseLock. ¿No necesito el kit de limpieza?
Ah, y bienvenidos a biology.SE :)
Gracias. Acabo de empezar con Home Brewing.SE y vi que también había uno de biología. Parece una buena idea. ;-)
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