¿Cómo puedo purificar el ARN después de la electroforesis en gel para eliminar la acrilamida residual?

A veces utilizo electroforesis en gel desnaturalizante a escala preparativa para purificar el ARN producido por la transcripción in vitro. El principal problema con esto es que la muestra después de la extracción del gel aún contiene cantidades significativas de acrilamida u oligómeros/polímeros de acrilamida.

El intercambio del tampón con Vivaspins no lo elimina de manera confiable; la precipitación del ARN también solo reduce la cantidad, pero no puede eliminar la acrilamida por completo.

En algunos casos, la acrilamida no interfiere mucho con los experimentos posteriores, pero hay algunos experimentos que no funcionarán con acrilamida en la muestra.

¿Cuáles son las opciones para purificar el ARN después de la electroforesis en gel que eliminarían de manera confiable la acrilamida de la muestra? Preferiblemente, deben ser simples y rápidos, no algo así como una ejecución completa de FPLC/HPLC.

¿Puedo preguntar por qué necesita purificar su ARN transcrito in vitro? He estado haciendo ARNm por IVT y he obtenido buenos resultados sin ninguna purificación más allá de la extracción con fenol:cloroformo y la precipitación con isopropanol.
@ user137 Uso el propio ARN para experimentos de RMN, lo necesito en un tampón diferente y sin el ADN ni la proteína para obtener espectros de buena calidad. Y cualquier otra cosa que todavía esté allí probablemente se superpondrá con algunas de las señales del ARN.
¿Cuánto ARN necesitas para la RMN? Siempre he oído que la RMN necesita mucho material para una buena señal.
@ user137 Dependiendo de lo que quiera hacer exactamente, necesita alrededor de 0.2-1.0 mM de proteína o ARN en su muestra en un volumen de 300-500 microlitros. Y para muchos experimentos también lo necesita marcado con 13C y/o 15N.
@MadScientist Tal vez hice mal mis cálculos, pero 500 ul de 1 mM de mi ARNm (1860 bases) serían 300 mg de ARN. Incluso si 300 ul de 0,2 mM serían aproximadamente 36 mg de ARN. Con una buena reacción de transcripción in vitro puedo obtener 200ug de ARN. Obviamente, un ARN corto necesitaría mucha menos masa para la misma molaridad.
@ user137 El ARN que investigaría con NMR generalmente tiene una longitud de alrededor de 15-150 nt, no ve mucho con NMR para nada más grande. Y simplemente hacemos las transcripciones in vitro a mayor escala, normalmente alrededor de 10-30 ml. El ARN también se mide casi siempre en tubos Shigemi, por lo que el volumen es de 300 ul, y aunque la concentración de 1 mM es ideal, no siempre se puede obtener tanto.

Respuestas (1)

Si no quiere acrilamida en su preparación, no la use, ya que siempre habrá algún remanente en la solución. Y no se deshará de él por completo, ya que al menos en parte coprecipitó con los ácidos nucleicos (se usa como agente de coprecipitación para este propósito).

Creo que la mejor solución es usar cromatografía, ya sea de exclusión por tamaño o resinas cargadas. Consulte estos dos documentos para obtener más información:

También usamos métodos cromatográficos, pero la purificación en gel tiene ciertas ventajas como una mejor resolución. No necesito deshacerme de la acrilamida por completo, sería suficiente reducirla significativamente por debajo de la concentración de ARN.
El gel es más fácil y rápido, la cromatografía tiene una mejor resolución y toma más tiempo. Ahora tienes que elegir lo que es más importante...
Sospecho que habría algún residuo de acrilamida sin polimerizar después de la carrera. El calentamiento debe descomponer la acrilamida en productos gaseosos (amoníaco, hidrógeno y monóxido de carbono). Ver aquí _ Sin embargo, no estoy seguro acerca de la descomposición térmica (no hay una referencia sólida).
¿Cómo puedo purificar el ARN después de la electroforesis en gel para eliminar la acrilamida residual?
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