Realicé una reacción de transcripción in vitro y produje algo de ARN de una sola especie y tamaño definido. Me gustaría visualizarlo para comprobar si la reacción funcionó.
¿Puedo hacer esto en un gel de agarosa? ¿Es suficiente simplemente hacer un gel de TAE-agarosa al 1% con EtBR que usaría para la electroforesis de ADN de rutina y ejecutar esto? ¿Es necesario tomar medidas especiales contra posibles ARNasas en el gel o en el tampón de ejecución?
Tiene dos posibilidades: cuando solo necesita una verificación rápida si su ARN está bien y, de hecho, solo obtiene una banda, puede probar un método "rápido y sucio". Calentar la muestra durante 5 minutos a 65°C y luego enfriarla inmediatamente en un baño de hielo y mantenerla allí hasta la carga. Al hacerlo, derrite la estructura secundaria del ARN y lo mantiene en este estado. Lo más probable es que entonces vea solo una banda.
Si esto no funciona o si desea utilizar un marcador de tamaño de ARN, no hay forma de evitar la electroforesis en gel desnaturalizante. Aquí desnaturaliza su muestra en el tampón de carga y luego ejecuta un gel desnaturalizante en el que previene las estructuras secundarias. Hay un buen artículo sobre esto:
El método clásico que usa formaldehído (que es más peligroso en el manejo) se describe en el siguiente artículo y también en el libro "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" de Maniatis y colegas:
El ARN puede plegarse, lo que produce una estructura secundaria y altera su movilidad (en comparación con el ADN superenrollado). Por lo tanto, si no desnaturaliza su ARN adecuadamente, incluso una sola especie producirá una mancha.
Una estrategia común es incorporar productos químicos desnaturalizantes como el formaldehído en el procedimiento. Consulte este protocolo de Life Technologies .
Aparentemente, también puedes hacer un gel de ADN estándar con un poco de lejía añadida . No he usado esta técnica, pero tienen algunos resultados similares.
rhill45