Estoy planeando ampliar una reacción de PCR y me pregunto si llenar los tubos de PCR al volumen máximo de 200 ul sería un problema. Significaría mucho menos pipeteo ya que solo necesitaría 1/4 de los tubos.
Los protocolos típicos que he visto siempre usan 50 ul para una reacción de PCR. Me pregunto si hay algún problema con volúmenes más grandes, por ejemplo, diferencias en la transferencia de calor, que podrían causar problemas si amplío el volumen en un tubo.
¿Es problemático aumentar el volumen? ¿Algún aspecto específico que deba considerar?
(También es demasiado largo para un comentario). Esta pregunta me recordó una anécdota contada por Arthur Kornberg sobre el enfoque de ampliación que adoptó Reiji Okazaki (descubridor de fragmentos de Okazaki ).
Aquí hay una cita tomada de For the Love of Enzymes: The Odyssey of a Biochemist de Arthur Kornberg
El estilo de investigación de Reiji no se desprende fácilmente de sus publicaciones, pero está vívido en mi memoria. Un ejemplo lo llamo la maniobra de Okazaki. Para purificar una enzima, utilizó un paso de calentamiento: 10 mililitros de la solución de enzima se mantuvieron en un tubo de ensayo a 70°C durante cinco minutos; luego las impurezas coaguladas se eliminaron por centrifugación. Cuando llegó al punto de escalar el procedimiento a varios litros, simplemente repitió el procedimiento de calentamiento original varios cientos de veces. Me avergonzó tener que informar de un procedimiento tan poco sofisticado en nuestra publicación. Pero luego me di cuenta de que él era capaz de completar este paso en unas pocas horas y no vio ningún sentido en perder un tiempo y material preciosos en aprender a calentar un vaso de precipitados grande o un matraz. Luego, cuando otro de mis alumnos purificó una enzima con un paso de calentamiento y tuvo que escalar su procedimiento 2000 veces de 3 mililitros a 6 litros, le aconsejé la maniobra de Okazaki: agregó 3 mililitros a cada uno de los 200 tubos de ensayo para llevar a cabo el calentamiento. y paso de centrifugado, repitiendo el procedimiento nueve veces. Otro estudiante que intentó calentar un gran volumen de esta enzima en un solo paso la perdió en un coágulo espeso.
Demasiado largo para un comentario: yo diría que depende de la PCR. Personalmente, he usado volúmenes máximos de 50 ul, si necesitaba preparar volúmenes más altos, hacía una mezcla que luego se distribuía a más tubos con 50 ul máx.
El problema de los grandes volúmenes es conseguir un calentamiento y enfriamiento rápido y homogéneo. Si el exterior del tubo es más rápido, la reacción allí ya comienza, mientras que este puede no ser el caso en el medio. Esto puede conducir a una desnaturalización y amplificación desiguales de su plantilla. Lo último es especialmente problemático cuando amplificas secuencias cortas. Allí, es posible que el tiempo de amplificación ya haya terminado y que el programa de PCR avance antes de que se termine la plantilla, lo que dará como resultado una menor cantidad de su producto completo y el enriquecimiento de versiones más cortas.
Hay otro problema que podría ocurrir en grandes reacciones: debido a los gradientes de reactividad debido a los gradientes de temperatura, creo que es posible que los reactivos (dNTP, iones de Mg) puedan formar gradientes que inhiban aún más un buen rendimiento.
Finalmente, probé una cosa en una de nuestras máquinas de PCR: el tubo de PCR se coloca en el bloque de calentamiento/enfriamiento. No está completamente insertado en el bloque, sino que sobresale parcialmente, por lo que si lo llena hasta su máxima capacidad, los 75-100 ul superiores (aproximadamente) estarían fuera del bloque calefactor y tendríamos un problema térmico. La mezcla de reacción solo se calentaría debido a la convección.