Estoy ejecutando reacciones de PCR con diferentes conjuntos de cebadores degenerados y quiero saber qué debe incluirse en la mezcla maestra.
Mi mezcla maestra habitual:
En hielo, agrego mis cebadores directo e inverso a los tubos de PCR apropiados, agrego la mezcla maestra a cada tubo de PCR, luego, justo antes de colocarlos en el termociclador, agrego taq y mezclo.
¿Es esta una forma adecuada de hacerlo? Obtengo el producto, pero estoy pensando que tal vez pueda mejorarlo cambiando lo que agrego a la mezcla maestra. Por ejemplo, ¿es mejor agregar taq en lugar de cDNA a la mezcla maestra y luego agregar cDNA antes de comenzar la PCR? ¿Está bien agregar cDNA y taq a la mezcla maestra juntos?
Siempre agrego el Taq a la mezcla maestra. Primero, facilita el manejo y evita pasos de pipeteo que pueden causar contaminación y también pueden olvidarse. Entonces la enzima es muy estable e incluso tolerará la temperatura ambiente sin problema. Dado que vamos a calentar este 30-40 hasta 95°C, esto claramente no es problemático. Dado que la mezcla de reacción se enfría, su reacción no comenzará. E incluso si lo hace, no habría mucha amplificación debido a la baja temperatura.
Por lo general, agrego todo lo que es igual para todas las reacciones a la mezcla maestra (esto también puede incluir el ADN). Si uso más de un ADN, divido la mezcla maestra por la mitad. De esta manera, no cometerá diferentes errores de pipeta para la plantilla, lo cual es especialmente importante para la PCR en tiempo real. Normalmente diluyo ligeramente los cebadores para poder pipetear volúmenes más grandes (simplemente uso una parte del agua utilizada para equilibrar la reacción de PCR). También puede premezclar pares de cebadores, si lo desea, nunca he visto problemas para hacer esto.