¡Obteniendo amplificación de PCR en recocido superior a Tm!

¿Estoy amplificando un gen en el que, en una pcr de gradiente, obtengo una amplificación a una temperatura de hibridación de unos 5 grados (67) más alta que la Tm (62,5)? ¿Que esta mal aquí? Además, obtengo una banda intensa muy fuerte con un tamaño incorrecto para todas las temperaturas probadas por debajo de Tm. por favor ayuda

¿Está calculando Tm de forma bioinformática, porque eso es solo una estimación? Si tiene mucho contenido de GC, su temperatura de fusión será más alta. También podría ser la concentración de sal de su búfer. Si son reactivos viejos, es posible que haya tenido algo de evaporación y su contenido de sal podría ser más alto de lo normal... Tampoco menciona si el tamaño incorrecto es más pequeño o más grande. Podrían ser dímeros de imprimación o podría tener un recocido fuera del objetivo. No es necesario que los cebadores sean completamente complementarios para hibridarse correctamente y, si tiene un cebador y una secuencia con mucho GC, podría hibridarse preferentemente.

Respuestas (3)

Es muy común obtener un recocido a una Tm superior a la predicha. Si es un problema en su caso, especialmente si tiene un recocido incorrecto a temperaturas más bajas, considere usar PCR de contacto para encontrar una temperatura óptima. O, pragmáticamente, si tiene alguna flexibilidad en el diseño de imprimaciones, simplemente pida un conjunto de imprimaciones y pruébelas todas. Los imprimadores son baratos hoy en día y, a menudo, encontrará un conjunto que funciona incluso donde los programas de diseño afirman que no funcionarán.

La Tm de los cebadores no diría mucho sobre las condiciones de la PCR. Cuando obtiene bandas no específicas, vale la pena probar una temperatura más alta.

Su intento temporal ya está cerca de la temperatura para extender, por lo que la PCR de transporte está disponible. Shuttle PCR tiene solo 2 pasos: 94 a 96 grados para fundir el ADN y 68 a 74 grados para hibridar y extender juntos.

Es posible que desee agregar DMSO o betain. Podrían ayudar a reducir el recocido incorrecto. Si las bandas no específicas son más pequeñas y más largas que las bandas que espera, los tiempos de extensión más largos y más cortos pueden brindarle mejores resultados, respectivamente.

Y recuerde, el diseño de la imprimación también es importante. Compruebe que tiene secuencias que se repiten en su plantilla y evite diseñar cebadores a partir de dichas secuencias.

Con respecto a la temperatura de recocido más alta que la Tm, a menudo uso una imprimación T7 de la cual la Tm es de 48,3 grados. La imprimación funciona bien a 55 grados de temperatura de recocido. Por lo general, los cebadores están en exceso en los tubos de reacción de PCR, lo que empuja el equilibrio químico hacia el recocido. Eso es lo que especulo.

La TM de la imprimación también se ve afectada por la concentración de sal de su mezcla. ¿Probaste el gradiente de PCR? O prueba el cálculo de Tm y toma en consideración la concentración de sal. http://www.biophp.org/minitools/melting_temperature/demo.php

Bienvenido a SE Biología. Es una buena idea mirar la fecha de las publicaciones, fácil de pasar por alto, especialmente en un teléfono, porque si está haciendo una pregunta al cartel o haciendo sugerencias prácticas en su respuesta, es posible que esté perdiendo el tiempo. Por supuesto, si la pregunta es científica y sientes que no ha sido respondida adecuadamente, adelante. (Pero no en este caso, creo).
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