Después de obtener el ADN recombinante, es común transformarlo en E. coli para detectar ADN recombinante y amplificarlo. Pero me gustaría preguntar, ¿podemos amplificarlo usando PCR?
Creo que habrá 3 moléculas de ADN después de la restricción-ligadura:
Para amplificar solo el plásmido recombinante, ¿podemos diseñar cebadores que abarquen el fragmento de inserción y el vector, que solo pueden emparejarse bien con el plásmido recombinante, pero con otros tipos?
Sin embargo, no sé si esta restricción en el diseño del cebador afectará el % de GC. Entonces, estoy pensando si podemos hacer un tratamiento con fosfatasa para evitar la autoligación, luego agregar exonucleasa para digerir todo el ADN lineal, es decir, solo retener el plásmido recombinante eventualmente, para que la restricción pueda superarse (ya que ahora podemos diseñar el cebador en la ubicación adecuada en el plásmido recombinante ), ¿puedo preguntar si esto es válido?
Después de la PCR, el plásmido recombinante se linealiza (2 extremos romos creados por cebadores directos e inversos si entiendo correctamente), lo que se vuelve menos estable ya que puede ser degradado por exonucleasa. Por lo tanto, ¿podemos agregar ligasa para circularizar el plásmido? ¿Pueden las ligasas ligar 2 extremos romos?
No sé si se puede hacer este método, pero estoy pensando que si solo queremos amplificar el ADN (no necesitamos el producto proteico) después de generar plásmidos recombinantes, ¿no será esto más eficiente que la transformación bacteriana?
Gracias y corrijan si cometí algún error.
No estoy del todo seguro de que reconozcas el proceso aquí. Generalmente, las bacterias se utilizan para la amplificación del plásmido a los niveles en los que lo usaría. Hacer esto por PCR es técnicamente posible, pero mucho más costoso, tiene una tasa de error más alta (debido a las polimerasas de ADN propensas a errores) y requiere pasos adicionales. Tampoco obtendrá tanto ADN como lo haría de un cultivo bacteriano. La cultura también es escalable: desea más ADN, solo cultive más bacterias. Una vez que haya transformado un plásmido en una cepa bacteriana, puede almacenar reservas de este a -80 en forma de glicerol. Luego puede raspar un poco, crecer durante la noche y realizar un procedimiento de <2 h al día siguiente y terminar con varios microgramos de ADN muy limpio.
Le recomiendo que lea un buen protocolo de clonación, como los que se encuentran en Sambrook et al., Molecular Cloning: un manual de laboratorio o Current protocols . La clonación existe desde hace más de 50 años, creo que el proceso está más o menos optimizado.
El proceso habitual de generar un plásmido es así:
Las bacterias generalmente digieren el ADN lineal a través de la producción de ADNas exógenas, y el ADN lineal a menudo no se transforma bien, por lo que su paso de exo-nucleasa es innecesario.
Por lo general, cuando examina colonias, utiliza cebadores específicos para el inserto o, si desea determinar si el inserto se ha insertado en una orientación específica, entonces un cebador en la columna vertebral y otro en el inserto. Solo la amplificación de ambos cebadores que produce una banda del tamaño correcto es una inserción positiva. En este caso, es posible producir cebadores que solo reconozcan aquellos plásmidos que tengan un inserto.
Hay algunos casos en los que puede generar cebadores que abarquen todo el inserto; la secuenciación de todo el inserto podría ser uno. Los plásmidos a menudo tienen este tipo de sitios ya incorporados. Si ve algo etiquetado como M13 o BGH, estos son sitios comunes para la secuenciación de cebadores. Otro uso común es si desea una variedad de insertos (por ejemplo, preparación de bibliotecas) y no sabe qué tan grandes pueden ser los insertos, entonces puede usar los cebadores que abarcan insertos para identificar plásmidos que se han autoligado (sin inserto) ya que estos solo producirán productos muy pequeños en un gel. No es posible hacer cebadores que abarcan insertos que solo reconozcan los recombinantes. No hay necesidad de ligadura o exonucleasas.
Otro escenario posible es donde desea cambiar una base (o más de 1) en un plásmido ya construido. Esto se denomina mutagénesis dirigida al sitio . En este caso, desea que la PCR rodee todo el plásmido, y el ADN parental (del plásmido) se daña por la digestión con la enzima de restricción específica de metilación DpnI (los productos de la PCR no están metilados, pero por lo general se cultivan en bacterias), y el producto circular mellado reparado por la bacteria después de la transformación.
Los imprimadores no afectarán el contenido de GC de su producto. Si no le gusta el contenido de GC de sus cebadores, muévalos a una ubicación más adecuada.
Antes, todo el mundo hacía un tratamiento con fosfatasa alcalina (AP) del ADN digerido para evitar la autoligación. En la práctica, los AP son muy difíciles de eliminar o inactivar y tienden a eliminar el fosfato necesario de su inserto cuando mezcla los productos en la ligadura. Esto conduce a la inhibición de la ligadura y reduce las posibilidades de éxito.
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