Almacenamiento a largo plazo de geles de agarosa-bromuro de etidio que ya se han colado

Se me ocurrió lo que pensé que era una idea inteligente: Almacenar los geles de agarosa que vierto y solo cortar tantos carriles como sea necesario para ejecutar más tarde, minimizando la agarosa desperdiciada (y el esfuerzo/tiempo desperdiciado) cuando necesito hacer muchas electroféresis utilizando un pequeño número de carriles.

Me di cuenta de que, con el tiempo, el EtBr se difundiría fuera de mi gel hacia el tampón en el que se guardan los geles. Como agrego 2 µl de EtBr a 50 ml de gel y los geles se mantuvieron en 400 ml de tampón TAE, agregué 16 µl de EtBr al tampón, razonando que ahora las concentraciones son iguales y no se producirá una difusión neta.

Sin embargo, después de varias semanas, noté que la señal de EtBr del gel está muy debilitada. ¿Qué puedo hacer para arreglar esto? Puedo ver las siguientes opciones:

  • Use una concentración más alta de EtBr en el tampón (¿cuánto?)
  • Cambie el búfer semanalmente, agregando EtBr nuevo cada vez
  • Cubrir el recipiente transparente con papel de aluminio para evitar un hipotético fotoblanqueo

¿Cuál es más probable que resuelva mi problema? ¿Debería simplemente rendirme y tirar los geles que tienen más de uno o dos días (quiero evitar esta opción, debido al mantenimiento de registros necesario para rastrear cuándo se hizo el gel por última vez)?

Lo que he visto es mantener una botella de gel de agarosa, luego calentarlo para que se derrita, verter lo que necesita en una rueda de gel, agregar su etidio. De esta manera, su reserva de gel grande no se contamina con etidio y no tiene que preocuparse por la pérdida de señal de etidio.
@user137 Estoy guardando geles moldeados para evitar la molestia de derretir y moldear un gel cada vez que quiero analizar algunas muestras. La botella de agarosa solo me ahorra el trabajo de pesar la agarosa, que es bastante insignificante en comparación.
¿Observó una señal reducida usando la misma concentración o construcción de ADN después de ejecutarla varias semanas después en un gel que no contenía ninguna banda de ADN procesada previamente? Creo que EtBr puede blanquear las fotos, así que solo use un tampón nuevo con EtBr nuevo. ¡Incluso con un EtBr estándar, debe envolverlo alrededor de una lámina! Los geles viejos generalmente no son buenos, ya que pueden volverse bastante duros y frágiles, según mi experiencia, por lo que siempre es mejor usar geles nuevos.
@Superbest Podría almacenar geles prefabricados sin etidio y luego teñirlos, pero terminaría con más desechos de etidio de los que preocuparse.
@Bez Sí, lo que hago es, primero hacer un gel con EtBr normal y pozos, etc., luego poner el gel en el tampón TAE con EtBr en el tampón, mantenerlo allí durante algunas semanas, ejecutar. Estoy comparando cantidades iguales de escalera, y parece que mi señal de un gel de dos semanas o más es quizás el 30% de uno nuevo (o 1-2 días).
@ user137 Sí, también es una opción. Sin embargo, quiero "pre-teñir" específicamente, es decir, aplicar EtBr después de que el gel esté completamente moldeado y listo para usar, pero antes de que esté realmente cargado con ADN. Solo estoy preguntando cómo lograr esto con una pérdida de señal mínima (sus sugerencias tienen sentido, pero ¿cuáles debo hacer realmente?). Si es imposible, una buena explicación de por qué también sería aceptable.
¡Me han dicho que para mantener un gel debo mantenerlo en un lugar frío y oscuro envuelto alrededor de una toalla húmeda! ¡Pero creo que es el foto-blanqueo el problema! así que sumérjalo en un tampón nuevo con EtBr fresco después de analizar sus muestras. ¿No empezó a tener moho en su tampón con gel durante semanas?
Vamos, @Superbest, lleva una cantidad de tiempo insignificante pesar y verter geles. Sírvelo antes de sentarte a revisar correos o facebook :P
@Superbest mira mi respuesta. Tuve que resolver esto antes. Además, si está tratando de guardar geles después de que se hayan ejecutado, puede usar un secador de gel (uno de esos utensilios de cocina con bolsa de aspiradora de alimentos que puede comprar en Target Work tan bien como los secadores de gel comerciales de $ 5000 para su información).
@WYSIWYG cierto, esto es trivial, pero si está preparando muchos geles como para 400 estudiantes para un laboratorio de enseñanza de pregrado, es mucho más fácil moldearlos, cortarlos y almacenarlos.

Respuestas (3)

Para prolongar la vida útil: después de que el gel se solidifique, humedézcalo con solución amortiguadora. Envuelva el gel en cloruro de polivinilo. Colocar en recipiente de plástico con tapa. Conservar en nevera en oscuridad. Durará un año siempre que lo vuelva a humedecer con un tampón cada vez que acceda a él. No lo mantenga sumergido en el búfer ya que el etbr se difundirá. esta es probablemente la causa de su problema. Tenga en cuenta que cuando pide geles prefabricados (ya sea de agarosa o de acrilamida), están sellados y solo se agrega un pequeño volumen de tampón para mantenerlo hidratado. Además, el etbr y el EDTA en el tampón ayudan a prevenir la mayoría del crecimiento de moho, aunque he visto crecer moho negro algunas veces alrededor de un año.

Siempre puede agregar etbr al búfer y agregarlo directamente a la cámara de electroforesis antes de ejecutar el gel (etbr ni siquiera necesita estar en el gel para que funcione), aunque creo que obtiene un poco más de sensibilidad con el etbr en el gel Si lo agrega, asegúrese de mezclarlo y déjelo reposar durante unos 20 minutos para que el etbr se difunda.

Si está tratando de reducir los costos, probablemente esté usando una agarosa de mayor calidad de la que realmente necesita para la aplicación que está haciendo, así que le echaría un vistazo.

Si termina necesitando almacenar geles para el trabajo de rna, agregue lejía Clorox simple a una concentración final del 1% a su gel TAE justo después de calentarlo en el microondas. Suena loco, pero funciona muy bien. ¡Inhibirá completamente la ARNasa y sus bandas de ARN se verán bien! El blanqueador también ayuda con el almacenamiento del gel.

OP ya ha declarado que las concentraciones de EtBr dentro y fuera del gel son idénticas.
@MarchHo Sin duda, el hecho de que sean idénticos no significa que no habrá difusión neta.
También puedo confirmar el almacenamiento del gel blanqueador, no solo eso, sino que, a pesar de no tener cuidado de mantener el gel blanqueador alejado de los contaminantes de ARNasa (manteniéndolo en la misma caja que los geles normales, el tanque de electroforesis sucio) mi ARN corrió y se tiñó muy bien .

Creo que tengo alguna evidencia de que el factor clave es la luz.

Desde que hice esta pregunta, cambié el tampón por TAE-EtBr fresco (la misma concentración que en mis geles) moví mis geles de un área bien iluminada a una caja opaca cerrada para que permanezcan en la oscuridad. Después de 1 semana, corrí cantidades iguales de mi escalera en el gel almacenado, así como en un gel fresco. Los resultados (gel viejo a la izquierda, gel nuevo a la derecha) muestran muy poca diferencia en la señal; concluyo que bloquear la luz es suficiente.

No estoy muy seguro de lo que estás haciendo. ¿Está ejecutando todo el gel cada vez y cortando los carriles que ha usado, o solo está poniendo los carriles que desea en el tanque y dejando el resto afuera?

Si es lo primero, entonces el bromuro de etidio se filtrará del gel porque está cargado positivamente, por lo que cada vez que se le aplica una corriente, parte de él se va.

Si es lo último, no estoy seguro de por qué está almacenando su gel en un búfer. Envuélvalo en una película adhesiva para evitar que se seque y guárdelo lejos de la luz ultravioleta para evitar que el etidio se degrade.

Sin embargo, francamente, no estoy seguro de por qué crees que esto será un gran ahorro de tiempo. Puede almacenar agarosa prefundida con bromuro de etidio agregado durante un período de semanas y verter un gel nuevo no lleva mucho tiempo.

Es el último. Tengo un gel grande almacenado en un contenedor (más fácil de abrir y cerrar que la película), y corto los carriles que necesito y ejecuto solo esos carriles.
Almacenamiento a largo plazo de geles de agarosa-bromuro de etidio que ya se han colado
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