Productos PCR sin banda en gel

Soy un estudiante de doctorado y me quedé con la ausencia de banda en los resultados del gel.

estoy usando lo siguiente

  • 1 microlitro Primer R (20 mM)
  • 1 microlitro Primer f (20mM)
  • 1 microlitro de dNTP (10 mM)
  • Plantilla de ADN de 1 microlitro (448 ng)
  • 1 microlitro de polimerasa TAQ
  • Tampón de 5 microlitros (10x) añadido MgCl2 en proporción 1:1
  • 30 microlitros de agua grado PCR

Programa:

  • 95 por 4 minutos
  • 95 por 45 segundos
  • 55-65 por 1,20 minutos
  • 72 por 1 minuto
  • Gradiente 35 ciclo
  • 72 por 4 minutos

Gel:

110 voltios, 200 mPA durante 30 - 45 minutos

Recibo productos PCR como en las imágenes. No hay bandas, mientras que hay bandas intensas en el fondo y algunos de los pozos.

Mi pregunta es, ¿eso está en los productos inferiores? ¿Qué se puede hacer para que sean reales? Si no es así, ¿por qué hay diferencias entre los dos carriles de pozos? Cada 12 pocillos representan un tipo de plantilla de ADN (utilicé ADN de tres organismos diferentes).

ingrese la descripción de la imagen aquí

Primero: su PCR funciona en principio, las bandas en la parte inferior son hermosas bandas de dímero de cebador que indican esto. Entonces: ¿Cuál es la fuente de su ADN y alguna vez ha sido utilizado con éxito para PCR? ¿Como se prepara?
Hola Cris, gracias por tu respuesta. El ADN es de bacterias LLactobacillus y Lactococcus. La imprimación se ha diseñado como degenerada en base a ambos. Hasta ahora no pude hacer funcionar la PCR.
La escalera se ve bien...
¿Puede publicar la secuencia que pretende amplificar y las secuencias de los cebadores que está utilizando? Además, ¿tiene algún control positivo para el Taq?
¿Usas ADN genómico? Luego, puede intentar mejorar el resultado usando menos plantilla o agregando MgCl2 adicional. También puede probar diferentes métodos de PCR (es decir, PCR con picos o Touchdown).

Respuestas (5)

Utilice imprimaciones de control dirigidas a algo que con seguridad da un producto. Si no tiene ninguno, pregúntele a sus colegas o tome algunos de la literatura. Asegúrese de que su producto sea lo suficientemente pequeño para amplificarse en el tiempo indicado y verifique la banda correcta con una enzima de restricción.

No estoy seguro de la escala de su escalera, pero a pesar de que el ADN que causa las bandas es muy pequeño. Lo más probable es que sean dímeros de cebadores. Verificaría las secuencias de los cebadores para asegurarme de que no haya mucha complementariedad. También puede intentar manipular las condiciones de reacción, como la concentración de cloruro de magnesio o los cebadores, etc. Ejecutaría un conjunto de optimización de PCR con condiciones de reacción variables.

Mi primera suposición sería que está usando demasiado ADN molde para estas condiciones. Sus pozos se iluminan bastante, 448 ng también está en el lado alto.

Pruebe con concentraciones más bajas de ADN molde (1-100 ng), tal vez solo con un paso de hibridación a 55 °C. Por el momento, no tiene ningún producto, por lo que no me preocuparía por la falta de especificidad todavía (y 10 °C también es un rango bastante pequeño para solucionarlo).

Otras cosas que destacan:

  • Supongo que es una imprimación de 20 uM, no mM
  • Estás agregando demasiado búfer
  • Parece que está haciendo cada reacción individualmente (mirando las cantidades de la plantilla en los primeros 12), sugiero hacer una mezcla maestra y alícuotas.
  • Tiene bastante espacio para ejecutar su gel por más tiempo, eso podría ser muy útil si obtiene algún producto.

Deberías tener un poco más de información también. ¿Cuál es el tamaño de los productos que espera? ¿Utiliza organismos de alto GC? ¿Estos cebadores funcionaron antes para otras personas? ¿El ADN genómico funcionó antes para otras personas?

NEB tiene mucha información útil sobre PCR y otros trabajos de ADN en su sitio web, échale un vistazo: https://www.neb.com/tools-and-resources/usage-guidelines/guidelines-for-pcr-optimization-with -taq-dna-polimerasa

Lo que puede probar son diferentes soluciones tampón (10x), también con o sin MgCl2. En el laboratorio donde solía trabajar con PCR, teníamos un panel de diferentes tampones de PCR en el congelador. Probamos algunos de ellos para ver cuál se ajustaba mejor (por lo tanto, cuál proporcionaba el tamaño de banda correcto). Al igual que su gradiente de temperatura, para ver cuál funciona mejor.

Puedes probar con una PCR de touchdown . A menudo es útil cuando no hay una banda presente.

Productos PCR sin banda en gel
RespuestasAquíPolítica de privacidad1y, 1v