No aparecen bandas en la electroforesis en gel, ni siquiera el marcador

Lo que puedo pensar rápidamente es que estaba ejecutando el gel incorrectamente: en lugar de la dirección de - a +, lo ejecutó al revés y su ADN salió del gel. Otra cosa puede ser que la luz ultravioleta no se haya encendido o esté rota.

Aquí están mis $ 0.02 en la resolución de problemas:

Veo carriles de gel cuando saco el gel del aparato,

Bien, está cargando su gel correctamente y la densidad es correcta, por lo que el ADN se encuentra en el fondo de los pocillos.

pero cuando voy a fotografiarlos: no aparece nada.

Esto apunta a un problema con la formación de imágenes: no hay suficiente EtBr, no hay suficiente ADN, bombilla UV quemada, filtro UV incorrecto o configuración incorrecta de la estación de imágenes.

Solo dejé que las muestras "corrieran" durante 30-40 minutos (cuando corrí durante una hora, las bandas casi se salen del gel).

Ejecutó la electroforesis en la dirección correcta y no lo suficiente como para sacar las bandas completamente del gel.

Intenté usar diferentes marcadores: sin suerte.

¿Está cargando suficiente ADN con estos marcadores?

Se volvió a agregar un poco más de EtBr para teñir mejor el gel: no hubo suerte.

Sospecho que hay un problema con el sistema de documentación del gel.

También mantengo las luces apagadas en la habitación oscura, por lo que no creo que esté exponiendo la película a la luz desde el principio (aunque los errores aún son una posibilidad). ¿Estoy sacando la película demasiado pronto?

No sé de qué estás hablando aquí. EtBr es un tinte fluorescente bajo iluminación ultravioleta y normalmente no requiere película fotográfica. Algunos sistemas capturarán una imagen del gel usando una especie de cámara "Polaroid", pero eso funciona porque el gel se expuso a la luz ultravioleta y la luz entrante se filtró en consecuencia. Sin embargo, la mayoría de los sistemas utilizan un sistema de documentación en gel con una bandeja de transiluminación y un sistema de cámara digital para tomar una imagen.

Algunas cosas para probar:

1) Prepare dos muestras: un carril de marcador estándar y un carril de ADN de concentración conocida (cargue una gran cantidad de ADN, como 1-2 ug de plásmido para saber que no se puede perder la banda). Agregue 1 ul de EtBr a la muestra de cada carril, mezcle y luego cargue el gel. Ejecute el gel usando sus parámetros habituales, manteniendo un ojo en el frente del tinte migratorio para asegurarse de que no se extraiga el ADN del gel. Esto asegurará que tenga dos buenas muestras que deberían aparecer en el gel y que sean bastante brillantes debido al exceso de EtBr.

2) Imagen del gel. Cosas para verificar dos veces aquí:

• ¿La longitud de onda de emisión es correcta? EtBr requiere iluminación UV de onda corta o media (250-300 nm), pero algunos sistemas también tienen iluminación de onda larga. La onda larga no funcionará.

• ¿Hay una configuración de filtro correcta? EtBr emite fluorescencia con un pico rojo (595 nm máx.), y si se coloca un filtro para eliminar esta banda, tampoco verá nada. Por lo general, no hay filtro o hay una opción de filtro "EtBr/UV". Aquí hay un documento técnico con un ejemplo de configuración para la captura de EtBr.

• ¿La cámara está configurada con una velocidad de obturación/tiempo de exposición adecuados? Intente experimentar con 20 ms a 200 ms. En nuestro sistema, 40 ms es ideal. Un tiempo de exposición demasiado corto significa que no verá nada.

• ¿Está el iris de la cámara ajustado al máximo? Si el iris se cierra demasiado, restringe la luz entrante para la formación de imágenes y no se formará ninguna imagen o se formará una imagen débil. Esto también afectará el tiempo de exposición ideal (ver arriba).

• ¿La cámara está enfocada y operativa? ¿Puede obtener una imagen de un objeto como su mano enguantada o el gel físico antes de obtener la configuración correcta de EtBr?

Puede que su gen de interés no se clone perfectamente, esa es la razón, asegúrese de que primero tiene que ejecutar PCR bien de acuerdo con su secuencia y luego ejecute el gel.