Cuantificación de ADN en una banda en electroforesis en gel

Soy un estudiante universitario de ciencias de primer año y solo hago esta pregunta como una pregunta más teórica en lugar de llevar a cabo un protocolo, por lo que agradecería que las respuestas no involucren muchos nombres químicos complicados.

Me preguntaba cómo se haría para cuantificar la cantidad de ADN en una banda dada en una electroforesis en gel. Algunas ideas que he tenido hasta ahora son:

  • Recorta la banda de ADN y extrae el ADN. Cuantifique utilizando algún método conocido, como medir la absorbancia a 260 nm del ADN en solución para encontrar la concentración.
  • Cuando el ADN se tiñe con bromuro de etidio, claramente habrá una mayor absorción de tinción en una región de banda si tiene más ADN, por lo que emitirá fluorescencia con mayor intensidad cuando se ilumine con luz ultravioleta. Sin embargo, tengo mis reservas sobre el uso de este método porque creo que la cantidad de tinción absorbida también dependería del estado del ADN (es decir, si está superenrollado o no), pero, de nuevo, no sé cuánto impacto esto podría influir en la cantidad de tinte absorbido. Por supuesto, si sabe que todo su ADN está en el mismo estado, creo que no debería haber ningún problema con este método. Aunque aquí habría que tener en cuenta que la concentración de bromuro de etidio en una determinada banda depende de la concentración de nucleótidos allí, que depende tanto del número de fragmentos de ADN como de su tamaño (que se conoce por la posición de la banda). Compare esto con el método final...
  • Finalmente, si uno está haciendo el ADN, por ejemplo, usando terminación de cadena didesoxi/secuenciación de Sanger en PCR, entonces puede usar un cebador marcado radiactivamente. La intensidad de la imagen en el radioautógrafo le indicaría directamente el número de moléculas de ese fragmento de ADN presente en la banda.

Me preguntaba cuáles de estas son opciones viables para usar en el laboratorio y por qué/por qué no.

Respuestas (1)

Los tres métodos podrían usarse para medir la cantidad de ADN. Sin embargo, en la práctica, el método 2 (estimación por el brillo del colorante) normalmente funciona mejor en un flujo de trabajo normal. Realmente depende de lo que planee hacer como su aplicación posterior.

Problemas con el método 1:

  • El rendimiento de los métodos de purificación en gel a veces es quisquilloso y propenso a perderse.
  • La absorbancia de la agarosa restante puede influir en los resultados. La limpieza del ADN es imprescindible.

Problemas con el método 2:

  • La cuantificación es difícil ya que debe estimar el brillo de la banda contra un estándar conocido (agregue una cantidad conocida de su escalera y utilícela para la estimación).
  • El superenrollamiento de plásmidos hace que aparezcan múltiples bandas, por lo que la estimación debe realizarse varias veces y luego agregarse (ahora es menos una estimación y más una conjetura)

Problemas con el método 3:

  • Trabajar con radiactividad agrega una cantidad significativa de protocolos de seguridad en un procedimiento simple
  • Todos los productos de radiomarcaje también deben manipularse como material radiactivo.
  • El uso de una imagen tiene el mismo problema que el método 2, en el que se estima en lugar de cuantificar.
  • Podría obtener más resultados cuantitativos con un contador de centelleo, pero luego los productos se vuelven más difíciles de usar debido a la purificación del fluido de centelleo (tal vez esto sea posible, pero nunca lo probé).
  • Está limitado a los procedimientos que incorporarían los nucleótidos radiomarcados
  • Si hace algo como dA-tailing, entonces no está cuantificando la cantidad de ADN, sino la cantidad de copias de una transcripción.
Cuantificación de ADN en una banda en electroforesis en gel
RespuestasAquíPolítica de privacidad1y, 2v