Estoy tratando de construir una biblioteca NGS en ADN enriquecido (longitud de ADN = 93 pb). Estoy utilizando la amplificación por PCR con dos cebadores sobresalientes, ambos con secuencias adaptadoras de Illumina (adaptador universal y adaptador TruSeq con código de barras). Mi biblioteca final debería ser (~ 182 pb):
Adaptador universal (-), ADN enriquecido (+), Adaptador TruSeq (=)
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Después de la amplificación por PCR y control de calidad por gel, estoy viendo fragmentos de mayor tamaño. El análisis realizado por Bioanalyzer indica que es posible que esté obteniendo algo de polimerización del adaptador TruSeq en la biblioteca. Lo más probable es que esto se deba a un mal diseño del cebador, ya que el cebador contiene dos secuencias de reconocimiento (21 nt), una en el extremo 3' y otra en el extremo 5' del adaptador TruSeq.
Mi pregunta es:
¿Cómo se vería afectado el análisis NGS si una biblioteca se envía para secuenciación y contiene una combinación de adaptadores TruSeq simples y dobles?
Soltero:
Adaptador universal (-), ADN enriquecido (+), Adaptador TruSeq (=)
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Doble:
Adaptador universal (-), ADN enriquecido (+), Adaptador TruSeq 1(=), Adaptador TruSeq 2(=)
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¿Se perdería la información de secuenciación de la "biblioteca doble" o se leerían bien esos fragmentos?
Gracias,
En resumen, puede perder información de su biblioteca debido a la longitud de los fragmentos que está secuenciando.
Cuando configure su ejecución de secuenciación, establecerá el parámetro para la cantidad de ciclos de secuenciación, lo que determinará la duración de las lecturas que se secuenciarán. Cuanto más largos sean los fragmentos contenidos en su biblioteca, menos estarán completamente secuenciados.
Una buena idea sería secuenciar los fragmentos polimerizados sospechosos para verificar que la polimerización del cebador realmente se está produciendo. Simplemente envíe su muestra para la secuenciación normal, como lo haría con plásmidos y fragmentos de PCR.
Si sus cebadores se polimerizan debido a un diseño ineficiente, debe corregir esto antes de cargar su biblioteca en el dispositivo Illumina. Si el efecto del dímero de cebador comprende una parte significativa de su biblioteca, esto solo se amplificará durante la ejecución y definitivamente puede conducir a una biblioteca significativamente menos compleja. Secuenciar una biblioteca de baja complejidad es un error realmente costoso cuyo único resultado garantizado es enfurecer a su asesor y hacer que cuestione en voz alta su competencia. Confía en mí.
Bosque