Posibles razones por las que el ADN se atasca bien

Hay una razón simple para eso, lo más probable es que su gel de agarosa sea demasiado denso. Dependiendo del tipo de agarosa, prepararía un gel al 0,5-0,6% como máximo.

Synbio da esta lista de agarosa "estándar", que encaja bastante bien con mis experiencias. Si usa agarosa de bajo punto de fusión, esta tabla se ve un poco diferente, ya que la matriz del gel no es densa. La desventaja es que el gel es mucho más propenso a dañarse durante la manipulación.

Después de revisar su gel, le conviene verificar los cebadores, la preparación, la calidad del propio XNA, luego los niveles adecuados de electroforesis y otras fallas mecánicas. Creo que la resistencia inadecuada del cableado de electroforesis causaría su problema.

Primero, como mencionaste, que creo que es clave, es necesario aclarar qué muestra de ADN es la que estás observando en el gel. Lo mejor que puede hacer para asegurarse de que solo tiene muestras de ADN generadas por PCR es que una vez que termine su PCR, trate su mezcla de ADN con la enzima Dpn I, que corta el ADN metilado, que es esencialmente ADN celular a medida que se metilan en las células y se no debería afectar su ADN generado por PCR, ya que no se metilará. Consulte la página 7 y la página 12 de este documento para obtener más instrucciones sobre el uso de Dpn I ( http://www.chem.agilent.com/library/usermanuals/Public/210518.pdf ). Posteriormente, puede limpiar y aislar el ADN generado por PCR utilizando cualquier kit, como el kit de extracción de gel QIAquick (QAGEN), utilizando esencialmente este protocolo, pero no está utilizando ningún gel (http://sites.bio.indiana.edu/~chenlab/protocol_files/agarose_gel_extraction.pdf ). Puedes usar otros kits, ¡pero este siempre funcionó para mí! (¡Tenga en cuenta que no estoy promocionando ningún kit aquí!) Ahora, si tiene algún amplicón de su PCR, entonces debería poder nanodropearlo (usando la relación 260/230 como guía) y obtener un valor razonable para su concentración de amplicón.

Ahora bien, si en esta etapa aún tiene su ADN de PCR como lo indica nanodrop y tal vez un resumen de la prueba aún arroja las bandas esperadas, entonces el problema está en el proceso en ejecución y es muy probable que su gel sea lo primero que sospeché que era el caso. Si no, entonces no tiene ningún amplicón y simplemente está tratando de ejecutar su ADN original.

Aunque nunca antes había trabajado con moléculas de ADN celular muy grandes (trabajo con plásmidos), me entrenaron para procesar ADN muy grande (en gel de agarosa) con un voltaje muy bajo, como 10-50 V, durante la noche en una habitación fría desde grandes El ADN celular no tiende a funcionar muy bien en geles, aunque eso se aplica principalmente al ADN cromosómico, pero 10 kb sigue siendo bastante grande. ¡He procesado ADN plasmídico de 12 kb en geles antes a voltajes más altos, pero el voltaje bajo es mejor y evita rasgar y cortar el ADN!