¿Por qué solo se utiliza un cebador para la secuenciación del ADN en lugar de dos?
Vale gracias
Entiendo que la PCR usa dos cebadores que se fusionan con los dos ssDNA para amplificar exponencialmente un ADN y que la secuenciación de Sanger usa solo un cebador porque una secuencia se puede determinar usando solo un cebador y una cadena sencilla con ddNTP. Sin embargo, he leído esto:
"La secuenciación utiliza un cebador, mientras que la PCR utiliza dos. Si tratamos de secuenciar con dos cebadores presentes, obtendrá las dos secuencias, superpuestas entre sí y completamente ilegibles".
Sin embargo, estoy luchando por visualizar por qué usar dos sería un problema, ¿cómo hará eso que el ADN sea ilegible?
¡Gracias de antemano!
Respuestas (1)
cris
La reacción para la secuenciación de Sanger contiene debajo de los dNTP normales (que son necesarios para producir la mayor parte del ADN) los didesoxinucleótidos, que carecen del grupo 3'-OH y que están marcados con un tinte fluorescente. Una vez que se incorpora uno de estos nucleótidos, la reacción en cadena se detiene aquí, dando lugar a un producto con una longitud específica y una base terminal conocida (por el colorante fluorescente).
En teoría, esto conduce a productos de una longitud de cebador + 1 base ddNTP, cebador + 1 base + 1 base ddNTP, cebador + 2 bases + 1 base ddNTP y así sucesivamente. El secuenciador separa estas bases por tamaños y luego lee secuencialmente el colorante fluorescente y lo traduce en una secuencia de bases. Ver la imagen de la Wikipedia para la ilustración:
Si ahora agrega dos cebadores (y, por supuesto, tiene un ADN de doble cadena), esta reacción comenzará en ambos extremos del ADN (siempre en la dirección 5'--> 3') y dará lugar a dos conjuntos de ADN marcado del mismo tamaño. (así que de nuevo la base + 1 ddNTP, base + 1 base + 1 ddNTP y así sucesivamente). Dado que estos son del mismo tamaño, siempre leerá dos bases al mismo tiempo y no podrá saber qué señal pertenece a qué hebra. Esto se ve así (desde aquí) :
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