Actualmente estoy trabajando en un conjunto de diversidad, esta diversidad en interespecífica (dentro del mismo género). Estoy usando marcadores SSR, los cebadores se diseñaron en una especie y están funcionando muy bien dentro de la especie (mucha diversidad y diferencia entre alelos de al menos 1).
Al probarlos en las otras especies, observo la no amplificación normal que podría deberse a una mutación en la secuencia de ADN del cebador. Pero, para algunos genotipos, he estado observando un nuevo alelo justo entre los dos más antiguos (como el nuevo es 185.5 y los más antiguos eran 185 y 186).
¿Es frecuente ese tipo de observación cuando se utilizan cebadores diseñados en otras especies?
Entiendo cómo podría ocurrir una diferencia de 1 pb CACACA==> CACCACA, pero ¿cuáles podrían ser las explicaciones biológicas para una diferencia de 0,5 pb entre alelos?
En mi experiencia, trabajando con un enfoque similar en Campylobacter jejuni , las mediciones de pares de bases de estas técnicas son imprecisas y deben calibrarse cuidadosamente. No me sorprende ver diferencias de 0,5 pares de bases, esto se puede ver en carreras e incluso, en el peor de los casos, entre pocillos pares e impares en la misma placa (!).
Usaría la secuenciación de Sanger para determinar la secuencia que está obteniendo en uno de sus aislamientos y luego usaría esto como un control de calibración incluido en cada ejecución.
Untitpoi
Jack Aidley
Jack Aidley