¿Por qué se combinan la PCR y la clonación como formas de amplificación de secuencias?

¿Por qué se combinan la PCR y la clonación como formas de amplificación de secuencias? ¿No dan el mismo resultado? Estaba leyendo el artículo https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1864885/ y me confundí con el siguiente pasaje:

Clonación y secuenciación genómica con bisulfito

Cada muestra de ADN convertida con bisulfito se sometió a PCR mediante cebadores que no discriminaban entre secuencias metiladas y no metiladas, utilizando un kit de reactivos centrales GeneAmp PCR (Applied Biosystems). Las secuencias de cebadores se enumeran en la Tabla 1 y las condiciones de reacción se enumeran en las Tablas complementarias 1C y 1D (disponibles en línea en http://ajp.amjpathol.org). Cada producto de PCR subsiguiente se clonó con TA en pGEM-Teasy vector25 (Promega) para su transformación en la cepa JM109 de Escherichia coli, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los clones se seleccionaron al azar y luego se realizó una PCR de colonias utilizando los cebadores de vector T7 y SP6 para amplificar los insertos clonados. La secuenciación del ciclo se realizó utilizando BigDye versión 1.1 (Applied Biosystems) y un secuenciador automático de ADN capilar Genetic Analyzer 3100 (Applied Biosystems). Las secuencias obtenidas se alinearon y compararon utilizando el software SeqScape (Applied Biosystems). Primero se confirmó la integridad de la conversión de bisulfito antes de la puntuación. Los sitios CpG secuenciados como residuos de citosina o timina se puntuaron como metilados o no metilados, respectivamente.

¿Alguien puede comentar para qué sirve la clonación cuando la amplificación ya está hecha por PCR?

Respuestas (1)

Hay varias razones para clonar un producto de PCR, pero las razones principales incluyen la expresión del producto y el mantenimiento económico de la biblioteca.

En el estudio que mencionó, la clonación y la transformación aparentemente se realizan para obtener clones individuales (de colonias individuales).

Los clones se seleccionaron al azar y luego se realizó una PCR de colonias utilizando los cebadores de vector T7 y SP6 para amplificar los insertos clonados. La secuenciación del ciclo se realizó utilizando BigDye versión 1.1 (Applied Biosystems) y un secuenciador automático de ADN capilar Genetic Analyzer 3100 (Applied Biosystems).

Dado que la PCR original tendría una mezcla de diferentes secuencias, la clonación se realiza para separarlas y facilitar su estudio mediante secuenciación. Si no separan las secuencias, tendrían que usar NGS (o métodos más caros como PacBio para lecturas más largas). Han utilizado la secuenciación de Sanger. Este artículo se publicó en 2007. En ese momento, NGS no era tan barato como lo es hoy y, por lo tanto, no todos lo usaban. Además, las máquinas NGS de esa época tenían longitudes de lectura aún más pequeñas (~40 para Solexa/Illumina GA y ~75 para GA-II). Teniendo en cuenta esto, la secuenciación de Sanger puede haber sido preferible a los autores de este artículo. Sin embargo, como mencioné antes, el método de Sanger no se puede usar para secuenciar muestras agrupadas; necesita plantillas puras o de lo contrario habrá señales mixtas y la llamada base sería inexacta.

(Vea el cromatograma de ejemplo a continuación: mire la posición con la Yque se ha mezclado Ty Cseñala. Sin embargo, no es de una muestra agrupada).
ingrese la descripción de la imagen aquí

Por lo tanto, fue necesaria la clonación, la transformación y la selección de colonias.

Además, en muchos casos sería necesario seleccionar clones individuales para realizar ensayos funcionales para asociar el fenotipo con el genotipo.

Gracias por la respuesta. No tengo claro algunos puntos que hiciste. ¿Por qué necesitarían usar PacBio? El producto de PCR inicial sigue siendo lo suficientemente corto para cualquier método de secuenciación de lectura breve. Entiendo la relación del fenotipo con el genotipo, pero este no es el caso aquí. ¿No es la clonación solo un paso que agrega un sesgo a la cuantificación de la relación de metilación?
@CindyAlmighty Necesita secuenciar moléculas de ADN individuales. Eso se puede hacer usando cualquier tecnología NGS pero no la secuenciación de Sanger. Sin embargo, para muchos de ellos, la longitud de lectura confiable es <300 nt. Con PacBio, puede secuenciar lecturas más largas. Sus lecturas son de hecho más pequeñas, por lo que no necesitan PacBio. Pero, tenga en cuenta que este artículo es de 2007 . NGS no estaba tan extendido ni era tan barato en ese momento. Podría haber un sesgo de amplificación entre las secuencias metiladas y no metiladas, pero eso estaría presente en la etapa del producto de PCR en sí.
Entiendo el NGS vs Sanger vs PacBio. No estoy seguro de cómo figura en este problema: cómo se acorta la molécula al insertar la clonación entre dos PCR.
@CindyAlmighty no se acorta. Este documento es de una época en que NGS no era común. Además, la secuenciación de Sanger puede brindarle hasta 1 kb de lectura de calidad decente. Sin embargo, con Sanger, no puede secuenciar una muestra agrupada. Solo causaría interferencia.
Oh, creo que ahora estamos en el camino correcto. Su ayuda es excelente, ya que me llevó sistemáticamente a una solución. Creo que este es el punto exacto que estaba buscando: Sanger no puede secuenciar muestras agrupadas. Pero ahora que lo pienso, no es interferencia, pero no seríamos capaces de desfasar las metilaciones. ¿Estás de acuerdo?
@CindyAlmighty no solo metilación. Si tiene varias plantillas en una reacción de Sanger, el cromatograma habría mezclado las señales y la llamada de base sería inexacta. En el caso de la misma secuencia molde pero con diferente metilación, habrá dos señales (después del tratamiento con bisulfito) en el sitio de metilación (C y T), cuyas intensidades dependerán de la frecuencia de los dos estados. Sin embargo, supongo que sería difícil calcular las frecuencias con precisión a partir de los picos de cromatogramas mixtos (nunca lo probé, así que no puedo decirlo de manera concluyente).
¿Por qué se combinan la PCR y la clonación como formas de amplificación de secuencias?
RespuestasAquíPolítica de privacidad1y, 0v