En la secuenciación de Sanger, ¿por qué recurrimos a la clonación? ¿Por qué la PCR no es suficiente?

Entiendo que en la secuenciación de Sanger podemos clonar nuestros fragmentos con la ayuda de, por ejemplo, bacterias para hacer múltiples copias de nuestros fragmentos para su posterior análisis.

También entiendo que la clonación puede ser un cuello de botella en la secuenciación de Sanger, y en parte impulsó el desarrollo de métodos NGS.

¿Pero PCR no hace exactamente eso, hacer múltiples copias?

¿Qué me estoy perdiendo?

Posible duplicado de Secuenciación de PCR
@MarchHo: pero... esa pregunta no es sobre Sanger :-|
En algunos casos, no conoce la secuencia que está buscando: clonación funcional, proyectos genómicos, clonación de ADN/ARN que se une a las proteínas que le interesan, etc.
Además, la PCR puede amplificar cualquier secuencia que tenga secuencias de cebadores en ambos extremos. A veces, no está seguro de obtener una secuencia correcta a partir de mezclas de ADN crudo.
Esto es imposible de responder sin conocer el contexto de lo que está tratando de secuenciar. Pero como alguien que ha secuenciado literalmente miles de exones del ADN genómico, la clonación obviamente no es necesaria para todos los proyectos de Sanger. Solo usé PCR para amplificar las regiones que me importaban.

Respuestas (2)

La tasa de error de la PCR sigue siendo muy alta en comparación con la replicación del ADN de bacterias naturales de sus plásmidos.

La replicación del ADN de bacterias naturales tiene una tasa de error de aproximadamente 1 en 10 mil millones , y la mejor PCR polimerasa disponible comercialmente (Q5 de NEB) tiene una tasa de error de aproximadamente 1 en 1 millón .

Por lo tanto, la clonación de fragmentos en bacterias y la secuenciación de los plásmidos clonados garantiza que tenga la secuencia correcta para más experimentos posteriores, ya que la tasa de error de la replicación de plásmidos naturales es mucho menor. Con PCR, es probable que se introduzcan algunos errores debido a las tasas de error más altas. Esto se vuelve cada vez más probable a medida que aumenta el número de ciclos de PCR y aumenta la longitud de los amplicones de PCR.

El hecho de que el amplicón de PCR secuencie correctamente no significa que el ADN clonado a partir del amplicón de PCR sea correcto. Por lo tanto, si la PCR está destinada a experimentos posteriores, es mejor secuenciar el plásmido clonado en lugar del amplicón.

Además, como WYSIWYG ha señalado en el comentario , tener el amplicón de PCR clonado en un plásmido también permitiría que las regiones del plásmido que flanquean el sitio de clonación se usen para la secuenciación. Esto permite utilizar cebadores de secuenciación estándar en el plásmido, en lugar de tener que diseñar nuevos cebadores de secuenciación para cada amplicón de PCR.

Además, dado que la secuenciación de Sanger requiere que los cebadores se unan ~50-100 pb aguas arriba de la región que se va a secuenciar, la clonación del amplicón en un plásmido también permitiría secuenciar amplicones cortos en una sola lectura, en lugar de requerir una lectura directa e inversa para secuenciación de un amplicón de PCR.

Esto no es correcto; o al menos, es sólo parcialmente correcto. Es cierto que la PCR tiene una tasa de error mucho mayor que la replicación bacteriana. Pero eso no es una preocupación importante cuando se secuencia el ADN agrupado de una reacción de PCR, porque si bien cada cadena amplificada puede tener errores, el promedio de la amplificación sigue siendo la secuencia original, porque solo una pequeña fracción de las cadenas tiene un error específico en un lugar específico. Sin embargo, si primero amplifica el ADN con PCR y luego lo clona y secuencia, tiene lo peor de ambos mundos, porque es posible que tenga errores en la pieza que clonó.
@iayork Si bien es cierto que la secuenciación directa de un producto de PCR es factible y se realiza con frecuencia, la gran mayoría de la clonación se realiza para transferir una porción de ADN a un vector para expresión de algún tipo. Si secuencia el producto de PCR antes de clonarlo, deberá volver a secuenciarlo después, ya que existe el riesgo de que el fragmento individual clonado sea incorrecto. En su lugar, tiene más sentido secuenciar un solo clon conocido. Por lo que sé, la secuenciación del producto de PCR generalmente se realiza para verificar que la PCR haya funcionado o para secuenciar tramos cortos de ADN en vectores largos.
Creo que tienes una visión bastante limitada de la secuenciación; He estado usando PCR con fines de secuenciación desde 1992 y no estoy solo. En cualquier caso, la publicación original no preguntaba cómo clonar, sino si había una razón técnica para la clonación con respecto a la secuenciación de Sanger. No hay uno; la secuenciación de PCR proporciona una secuencia muy precisa y su explicación de las tasas de error es engañosa.
@iayork Agregué una serie de razones técnicas para la clonación. Consideraría que estas son buenas razones para secuenciar un plásmido clonado en lugar del amplicón de PCR directamente.
Sin embargo, aún no ha corregido su comentario engañoso sobre las tasas de error de PCR.
@iayork No considero que las tasas de error sean engañosas. El objetivo es mostrar que la PCR produce errores en una proporción no trivial de amplicones, por lo que es necesario secuenciar varios clones derivados del amplicón si desea obtener un producto sin errores para los experimentos posteriores. Relevante para su propia respuesta, una "solución estándar y simple" para el problema de los errores en los amplicones de PCR es clonarlos y secuenciarlos.
Sí, pero te estás perdiendo el punto. La secuenciación del producto PCR no muestra los errores. Solo es un problema si desea clonar el producto. La pregunta original es si tienes que clonar para secuenciar. Tu respuesta es "Tienes que clonar porque si no clonas, entonces cuando clonas hay problemas". En serio, esto es algo muy básico.

Puede utilizar productos de PCR en la secuenciación de Sanger; Es muy común. El uso de productos de PCR en lugar de genes clonados plantea una serie de problemas que son menos preocupantes que con las secuencias clonadas, como la presencia de productos de PCR incompletos o incorrectos, pero existen soluciones estándar y simples para la mayoría de estas preocupaciones.

Y otros problemas menores como la eventual necesidad de clonación, la posibilidad de usar cebadores de secuenciación estandarizados después de la clonación (como T7), etc.
En la secuenciación de Sanger, ¿por qué recurrimos a la clonación? ¿Por qué la PCR no es suficiente?
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