Protocolo alternativo para evaluar la integridad del ARN, utilizando un gel blanqueador

Odio tener que ejecutar geles de agarosa MOPS PFA con DEPC y todo lo demás solo para verificar la integridad de mi ARN. Encontré un protocolo alternativo que usa lejía doméstica común en el gel para inhibir las RNasas y me preguntaba si alguien aquí lo había probado y cuál fue el éxito. O cualquier idea útil también es bienvenida.

aquí hay un protocolo que armé basado en lo que se hizo en ese documento.

Para un gel de 50ml EN un matraz Erlenmeyer de 250ml libre de RNasa Mezclar: 5mls de 10x TAE que te di 42.5mls de agua ultra purificada 0.5g de la agarosa que te di 2.5mls de lejía casera (hipoclorito de sodio al 6%, usa clorox)

Incubar 5-10 minutos.

Cocine en el microondas durante la cantidad mínima de tiempo en el nivel de calor más bajo que se necesita para solubilizar completamente la agarosa, no desea que se evapore ajustando el volumen de sus soluciones Verifique su volumen con una pipeta serológica estéril de 50 ml, si ha perdido más del 5% del volumen I reharía, usando menos calor.

Añadir 3 µl de 10 mg/ml de bromuro de etidio, agitar para mezclar. Vierta el marco de fundición, deje enfriar, sumerja en 1xTAE

Combine 1 µg de su ARN total, 2 µg de colorante de carga 6x libre de ARNasa y qs a 12 µl en agua libre de ARNasa, puede usar el agua del kit qiagen para esto. Ejecute a 100 V, aproximadamente 30 minutos, obtenga una buena imagen escaneada y use Photoshop para evaluar la intensidad de la banda. El 28S debería tener el doble de brillo que el 18S en una muestra con poca o ninguna fragmentación.

También odiaba los geles desnaturalizantes de ARN de agarosa, pero cambié a geles nativos usando el tampón de ácido bórico de litio de Faster Better Media a una concentración de 0.5X, mis geles se ven mucho mejor, aunque obtengo 2 bandas en cada carril porque no está desnaturalizado. ¿Cómo está utilizando los geles para verificar la integridad del ARN? Si veo una banda del tamaño correcto, la llamo lo suficientemente buena y sigo adelante. ¿Qué tan preciso debe ser un gel?
Mirando las subunidades pequeñas y grandes. El grande debe ser 2 veces más brillante en una muestra no fragmentada de ARN total. El gel no debe exhibir ninguna actividad de exonucleasa, no mucho más de lo necesario
Tal vez por eso he podido salirme con la mía con mis geles, estoy haciendo ARN a través de la transcripción in vitro, debes estar aislándolo de las células.
¡Estás en lo correcto!
¿Cuál es tu objetivo final? ¿Para qué necesitas el ARN? El rigor de la prueba depende de eso. Para la RT-PCR habitual, caliento el ARN con el tampón de carga 2x que contiene formamida y lo ejecuto en gel de agarosa normal con TAE/TBE a 120 V.
Prueba de integridad del ARN para Microarray
¿Por qué no simplemente ejecutar el ARN en una máquina de nanofluidos Agilent Bioanalyzer (o algo similar)? Es bastante barato y rápido, y estoy seguro de que muchos servicios básicos lo ofrecen ahora. Por supuesto, estoy haciendo ciertas suposiciones sobre la financiación y la disponibilidad de tecnología aquí...
@Cantona'sCollar ese es ciertamente el estándar de oro, pero no veo cómo es barato que esos chips tengan una vida útil muy corta para el volumen en el que tiene que comprarlo. Además, cualquier máquina de fluidos tenía el potencial de un costo desastroso.

Respuestas (2)

No creo que la lejía pueda desnaturalizar el ARN. La lejía es un agente oxidante y dañará el ARN. Además, el protocolo menciona la adición de hipoclorito antes del calentamiento, lo que creo que es ilógico porque el calor lo descompondrá.

Para probar la integridad del ARN, no necesita hacer un gel desnaturalizante. En cambio, lo que puede hacer es calentar el ARN con el tampón de carga 2xRNA que contiene formamida al 95 % y ejecutarlo en un gel de agarosa TBE/TAE normal. El calentamiento con formamida desnaturaliza el ARN de forma permanente.

Los geles desnaturalizantes solo son esenciales para Northern Blots.

También puede ejecutar su muestra en un bioanalizador para verificar la integridad del ARN y esto siempre se recomienda para experimentos de RNAseq (incluso para micromatrices, pero no puedo comentar mucho sobre eso porque nunca lo he hecho y no conozco la práctica habitual).

Te digo que yo tampoco me lo creía pero funciona bastante bien. No lo agregue a la agarosa antes de calentar en el microondas y use 6%. Además, el rna ya se desnaturalizará de la mayoría de los procedimientos de purificación, especialmente los estándar que usan guanidina. funciona bien para un laboratorio de enseñanza (barato y más fácil) y creo que este protocolo se enfoca en la eliminación o inactivación de la ARNasa. +1 para el reconocimiento de calefacción, pero estoy cansado de calentar rna a menos que se pueda calentar rápidamente. Puedo Ty esta próxima vez sin embargo.

El blanqueador no es para desnaturalizar el ARN, sino para destruir la ARNasa que podría estar al acecho en su agarosa o tampón: el calor no mata la ARNasa fácilmente, por lo que la ebullición no ayuda. Luego, simplemente ejecute un gel de agarosa normal (TAE/TBE o borato) y observe las intensidades relativas del ARN de LSU y SSU. Los geles blanqueadores funcionan muy bien para mí y obtuve muy buenos resultados de RNA-Seq a partir del ARN analizado de esta manera (no tengo acceso a un bioanalizador).

Agregue algunas referencias a su respuesta.
Protocolo alternativo para evaluar la integridad del ARN, utilizando un gel blanqueador
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