Ayuda para analizar el gel SDS-Page

En este experimento, transformamos un truncamiento de la secuencia de la proteína NFAT en un vector plasmídico para expresarlo en E. coli como una proteína de fusión con GST. También intentamos transformar el plásmido normal sin NFAT para poder obtener solo GST. Después de hacer crecer estas colonias y seleccionar colonias positivas, lisamos el e.coli. Recolectamos algo de este lisado para SDS-PAGE. Luego colocamos las soluciones de GST y GST-NFAT lisadas en columnas separadas con perlas de glutatión. GST se une al glutatión. Lavamos la columna y recolectamos parte del lavado para SDS-PAGE. Finalmente, eluimos GST y GST-NFAT de la columna y guardamos algunos para SDS-PAGE.

Adjunto una imagen de una versión exitosa de SDS-PAGE.

Desea dirigir su atención al primer carril, el marcador de peso molecular (MWM). El resto de los carriles debe interpretarse en grupos de 3. El primero de los tres es el lisado crudo, el segundo de los tres es el primer lavado y el último es la proteína de interés eluida. Los carriles importantes para mi análisis son 8-10 y 11-13.

Explicaré lo que sé de este gel SDS-PAGE hasta ahora. Conozco los pesos de las diferentes bandas en el marcador de peso molecular porque me dieron una copia de las diferentes proteínas en el marcador. A partir de esta información, pude confirmar que aislé mi proteína de interés en el carril 13 y aislé GST solo en el carril 10. También entiendo la razón por la cual los carriles de lisado son los más oscuros, seguidos por los carriles de lavado y luego muy limpios. proteína de carriles de interés. Además, tenga en cuenta que el marcador y los carriles de elución se cargaron con 10 microlitros mientras que los otros carriles tenían 2 microlitros cada uno. Sin embargo, hay algunas cosas que no entiendo del gel.
(1) ¿Por qué las bandas son tan difusas/de baja resolución? Me imagino que puede estar sobrecargando los pozos, pero no me convence porque seguí un procedimiento establecido.
(2) ¿Por qué hay grandes cantidades de rayas, especialmente en los carriles 5, 8, 9, 10 y 11?
(3) Aislé mi proteína de interés porque era una proteína de fusión con GST (o solo GST sola), y luego eluyó la proteína de las perlas de glutatión mediante un lavado con exceso de glutatión. Teóricamente, los carriles para las eluciones deberían estar libres de todo excepto la proteína de interés y el glutatión. Esto es válido principalmente para los carriles 4 y 9, que solo deberían tener GST y glutatión. Sin embargo, los carriles 7 y 13 solo deben tener GST-NFAT y glutatión. Sin embargo, los carriles no son tan claros y parecen haber teñido muchas otras proteínas. ¿Qué está pasando?
(4) Un profesor me dijo que la segunda banda en el carril 13 (el carril GST-NFAT) era un producto de degradación. ¿Cómo puede ser esto? La banda no corresponde a los pesos de NFAT solo o GST solo. Además, si se degradara el NFAT-GST, ¿no habría dos bandas de producto de degradación?
(5) ¿Por qué los carriles de GST solo tienen lo que parecen bandas de doblete? (Carriles 4, 10).
(6) Si eluimos las proteínas de interés con exceso de glutatión, que tiene un peso molecular muy bajo, ¿por qué no aparece en el gel? ¿Es posible que se haya escapado antes que todo lo demás?
(7) Tengo una lista de los pesos de las bandas del marcador molecular. Sin embargo, hay una banda adicional en la parte inferior que no aparece en mi lista. ¿Es posible que mi lista esté incompleta o está sucediendo algo más?

Finalmente, adjunto una imagen de un gel SDS-PAGE fallido.

Lo único que definitivamente sé que fue una fuente de error es el hecho de que mi nivel de búfer cayó durante la ejecución (debido a una fuga). Los resultados de este gel son precisos (los carriles 2-7 corresponden a los carriles 8-13 del gel anterior y los resultados son casi idénticos), pero el resultado del gel fue horrible. ¿Cómo puede la caída del búfer causar este resultado? ¿O hay algo más que pueda haber contribuido a este extraño patrón? Finalmente, los carriles no son tan distintos en este gel como en el primer gel, aunque se utilizó el mismo peine y, por tanto, pocillos del mismo tamaño y espaciados. Entonces, ¿por qué hubo tanto sangrado entre carriles/falta de espacio entre los carriles?

Gracias de antemano por cualquier ayuda.