Problemas de Laemmli-SDS-PAGE [cerrado]

Tu gel se ve muy bien para mí. Simplemente indica que su precipitado de sulfato de amonio contiene cantidades masivas de esta pequeña proteína en el fondo (sea lo que sea). Las bandas superiores se ven bien, la cantidad cargada es adecuada: no están sobrecargadas como la inferior, pero tampoco demasiado tenues. El hecho de que el primer y el último carril se vean un poco manchados se debe a la enorme cantidad de proteína pequeña (los carriles se ven manchados cuando se sobrecargan tanto). La banda inferior definitivamente es realmente alguna proteína, y no un artefacto de tinción; He visto esta forma antes con proteínas purificadas sobrecargadas en SDS-PAGE.

Una cosa que podría hacer, suponiendo que aún tenga suficientes de estas muestras, es ejecutar un gel complementario con 100 veces menos material. Diluir por un factor de 1/100 en tampón de desnaturalización Laemmli 1X y cargar un nuevo gel con el mismo volumen que para este. Ya no verá las bandas superiores, pero tendrá una banda inferior mucho más limpia a la que, con suerte, podrá asignar un peso molecular aparente (o incluso recortar para la identificación de especificaciones de masa; use guantes y use herramientas limpias si no haz eso, de lo contrario, en su mayoría detectarán la queratina de tu piel).

Suponiendo que el objetivo de este gel era verificar el resultado de la precipitación de sulfato de amonio utilizada como paso de purificación, obviamente no funcionó bien para separar todas estas bandas, y es posible que deba repetir y probar diferentes concentraciones. Pero si la banda inferior es la que está tratando de purificar, entonces tuvo éxito (las bandas superiores representan menos del 10% de contaminación, diría que a simple vista). Si estás interesado en una de las mejores bandas, entonces claramente no funcionó.

¿Es uno de estos carriles el sobrenadante? Si es así, también tiene cantidades masivas de proteína pequeña allí (está en cada carril). Un enriquecimiento tan alto parece sospechoso: ¿podría ser lisozima purificada que agregó durante el procedimiento de purificación para ayudar a romper la pared celular bacteriana? (suponiendo que está tratando de purificar una proteína sobreexpresada en E. coli ).