Se olvidó de agitar el anticuerpo antes de la tinción

Puaj. Hice un experimento de inmunofluorescencia el fin de semana pasado, olvidé agitar en vórtice mis soluciones de anticuerpos primaria y secundaria.

Y mi resultado final se ve más tenue de lo que debería ser. ¿Es posible que el no vórtice haya contribuido a esto?

Supongo que la pregunta es, ¿es realmente necesario el vórtice? Todo se reduciría a la dinámica de fluidos. ¿Cuánto tarda una gota de anticuerpo en alcanzar el equilibrio en un tubo Eppendorf de 1000 µL? ¿Es realmente más que unos pocos segundos? ¿Es realmente necesario el vórtex?

Respuestas (1)

Depende de cuánto tiempo transcurrió entre la adición de los anticuerpos concentrados a la solución de dilución y la adición de los anticuerpos diluidos al portaobjetos. Si fueron solo un par de segundos, entonces puedo ver absolutamente que hay una diferencia. Incluso si fuera más largo, digamos de 30 a 90 segundos, incluso, podría haber gradientes de anticuerpos en la solución sin agitar. Hay algunas razones por las cuales. En primer lugar, muchos anticuerpos primarios no conjugados que no están destinados solopara la inmunotinción se proporcionan en una solución de glicerol, con concentraciones que van desde el 10 % hasta el 50 % o más, a veces además de una proteína transportadora como BSA (solía trabajar para una conocida compañía de anticuerpos, y la suya está en Glicerol al 50% con 10 µg - 2 mg de BSA por ml, según el tipo de anticuerpo). El glicerol evita que la solución se congele a -20 °C, lo que elimina la formación de cristales de hielo, protege la proteína del anticuerpo de la degradación y permite tiempos de almacenamiento más prolongados sin pérdida de actividad. Como resultado, sin embargo, la solución tarda más en solubilizarse en PBS o cualquier diluyente que esté usando por sí solo, sin actividad mecánica adicional.

Por otro lado, incluso si el anticuerpo primario (o secundario) simplemente se formula en PBS, la difusión uniforme de las proteínas en todas las partes del tubo puede llevar algún tiempo. Como experimento, ponga 1 ml de PBS en un tubo Eppendorf, luego agregue quizás 10-50 µl de un tinte oscuro, como azul de metileno, azul de bromofenol o azul de tripán. Mírelo disociarse en la solución con el tiempo contra un fondo blanco sólido como una hoja de papel. Si bien ninguno de estos tiene exactamente el mismo perfil de solubilidad que los anticuerpos, es lo suficientemente bueno para mostrarle lo que sucede durante los primeros 30 segundos hasta que ya no puede distinguir el tinte.

Por lo tanto, siempre vórtice, incluso si es a una velocidad relativamente lenta, durante un par de segundos para asegurarse de que todo esté distribuido uniformemente.

Supongo que un tinte de molécula pequeña probablemente se difundirá más rápido que un anticuerpo grande. Entonces, si un tinte tarda en llenar todo el volumen, es probable que un anticuerpo necesite más tiempo.
@ user137 ese es exactamente mi punto.
Me enseñaron a nunca mezclar proteínas porque quería hacer algo útil, pero la mezcla uniforme (por pipeteo o inversión o nutación extendida o lo que sea) de una solución es bastante necesaria para que podamos decir algo significativo sobre cualquier reacción bioquímica. En conclusión, la respuesta de @MattDMO es correcta, lo que permite variaciones locales en las costumbres metodológicas.
@MaximilianPress te enseñaron incorrectamente. La única proteína que no agito es la ADNasa I, que se utiliza para digerir el ADN en una columna giratoria de preparación de ARN, y solo porque las instrucciones dicen que no se agite. Las proteínas son en general muy estables estructuralmente, y una fuerza débil como el vórtice no las dañará ni un poco, lo prometo. He estado trabajando con proteínas durante casi 20 años, y nunca he conocido a un bioquímico que dijera que las proteínas en general, o los anticuerpos en particular, no deberían mezclarse en un vórtice. Ahora, si está haciendo co-IP de conformación nativa, por ejemplo, puede ser un poco más (...)
(...) delicado que cuando se trabaja con un anticuerpo para Western blotting o inmunofluorescencia, pero incluso ahí el peligro es más el calor que la fuerza física. Los anticuerpos son increíblemente duros y resistentes, a menudo pueden funcionar en una amplia gama de entornos químicos y, en general, solo necesitan un tratamiento especial cuando se conjugan con fluorocromos sensibles a la luz. Sí, no desea que se formen necesariamente burbujas en su solución, pero nuevamente, eso es solo cuando está trabajando en un ensayo sensible a la conformación.
Gracias por tu respuesta. Imagino que no contienen glicerol, ya que se mantienen a -4 grados. Aún así, algo bueno a tener en cuenta. Definitivamente probaré el experimento del tinte. En ese sentido, ¿cuánto tiempo tardan, si es que lo hacen, los anticuerpos en "estropearse" a -4 grados? ¿Eso podría haber contribuido?
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@ amd1972 en respuesta a su pregunta, depende. Si hay azida de sodio en el anticuerpo, no debería contaminarse, especialmente si está usando puntas de pipeta con filtro (ya no uso puntas regulares). Puede consultar con el proveedor para ver si ha realizado algún estudio de estabilidad o si el lote que tiene tiene una fecha de vencimiento. Siempre que tenga cuidado con él, debería durar al menos un par de años; algunos pueden durar mucho más, otros no tanto. Si lo desea, puede agregarle 50% de glicerol y almacenarlo a -20, recordando etiquetarlo y alterar el factor de dilución.
Genial gracias. Una última pregunta. Hice otro hilo sobre esto: ¿qué pasa con el paso de enfriamiento con hielo después de la recuperación del antígeno que se encuentra en la mayoría de los protocolos de inmunofluorescencia? También olvidé ese paso. He estado en la escuela y ha pasado mucho tiempo desde que hice estos experimentos, así que, como pueden ver, estoy oxidado.
@ amd1972 no estoy seguro de eso: generalmente hago tinciones en células, no en tejidos, y estoy un poco oxidado en mi IHC.
Se olvidó de agitar el anticuerpo antes de la tinción
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