Usando Dcr-2 etiquetado con Flag recombinante y proteína X etiquetada con His, se realizaron ensayos desplegables para determinar si la proteína X y Dcr-2 interactúan directamente. Las proteínas recombinantes (solas o combinadas) en tampón de unión (NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, Tris 50 mM pH 7,5, Triton X-100 al 1 %) se extrajeron mediante anticuerpos Flag acoplados a perlas de Sepharose. Después de un lavado extenso, las proteínas se eluyeron de las perlas con tampón SDS y se analizaron conjuntos duplicados de muestras mediante SDS PAGE. También se tomaron muestras de las proteínas antes de usarlas en el ensayo desplegable y se corrieron en el mismo gel (carriles de entrada en la Figura 2B). Un gel se tiñó con colorante azul de Coomassie (Figura 2A) y el otro se transfirió a nitrocelulosa para el Western Blot. La membrana se sondeó con un anticuerpo His (Figura 2B).
La pregunta es: ¿Dcr-2 y la proteína X interactúan directamente?
Mi razonamiento es que interactúan directamente. En la Fig. 2B: las bandas intensas en LHS muestran que Dcr-2 interactúa con la proteína X-que está unida a anti-His. En la Fig. 2A: la proteína X interactúa con el Dcr-2 unido al anticuerpo FLAG. Siento que no estoy explicando esto muy bien... ¿Podría alguien explicar su razonamiento? Gracias
Primero: tiene razón con su razonamiento de que la Proteína X (X) y Dcr-2 interactúan directamente. Repasemos las transferencias: en la entrada, verifica las proteínas cargadas en la configuración y tiñe inespecíficamente con Coomassie. Esta parte de la transferencia no muestra información inespecífica y ambas proteínas de interés están presentes. Esto también muestra que Dcr-2 es mucho más grande que X, lo que permite una fácil identificación de los patrones de bandas.
En el eluato solo verá proteínas que se unen directamente en la reacción o que interactúan con proteínas unidas. Dcr-2 está marcado con bandera, por lo que se unirá directamente a las perlas y se podrá eluir de ellas. Esto se muestra en la parte coomassie de la transferencia. Dcr-2 solo se une y se puede eluir, mientras que X solo no se une y, por lo tanto, no da señal. Dcr-2 y X juntos dan dos bandas, sind Dcr-2 se une a las perlas y X interactúa con Dcr-2.
Esta unión también se muestra con el anticuerpo anti-His que solo reconoce la Proteína X. La proteína aparece en la entrada donde se agrega X. También aparece en el carril de elución (donde también está presente Dcr-2) y muestra que X es un compañero de interacción para Dcr-2.
cris