¿Una pregunta relacionada con la inmunoprecipitación para identificar proteínas que interactúan?

Usando Dcr-2 etiquetado con Flag recombinante y proteína X etiquetada con His, se realizaron ensayos desplegables para determinar si la proteína X y Dcr-2 interactúan directamente. Las proteínas recombinantes (solas o combinadas) en tampón de unión (NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, Tris 50 mM pH 7,5, Triton X-100 al 1 %) se extrajeron mediante anticuerpos Flag acoplados a perlas de Sepharose. Después de un lavado extenso, las proteínas se eluyeron de las perlas con tampón SDS y se analizaron conjuntos duplicados de muestras mediante SDS PAGE. También se tomaron muestras de las proteínas antes de usarlas en el ensayo desplegable y se corrieron en el mismo gel (carriles de entrada en la Figura 2B). Un gel se tiñó con colorante azul de Coomassie (Figura 2A) y el otro se transfirió a nitrocelulosa para el Western Blot. La membrana se sondeó con un anticuerpo His (Figura 2B).

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La pregunta es: ¿Dcr-2 y la proteína X interactúan directamente?

Mi razonamiento es que interactúan directamente. En la Fig. 2B: las bandas intensas en LHS muestran que Dcr-2 interactúa con la proteína X-que está unida a anti-His. En la Fig. 2A: la proteína X interactúa con el Dcr-2 unido al anticuerpo FLAG. Siento que no estoy explicando esto muy bien... ¿Podría alguien explicar su razonamiento? Gracias

Si la respuesta no le satisface, sería genial que me dijera el problema en un comentario, para que pueda mejorarlo. Gracias.

Respuestas (1)

Primero: tiene razón con su razonamiento de que la Proteína X (X) y Dcr-2 interactúan directamente. Repasemos las transferencias: en la entrada, verifica las proteínas cargadas en la configuración y tiñe inespecíficamente con Coomassie. Esta parte de la transferencia no muestra información inespecífica y ambas proteínas de interés están presentes. Esto también muestra que Dcr-2 es mucho más grande que X, lo que permite una fácil identificación de los patrones de bandas.

En el eluato solo verá proteínas que se unen directamente en la reacción o que interactúan con proteínas unidas. Dcr-2 está marcado con bandera, por lo que se unirá directamente a las perlas y se podrá eluir de ellas. Esto se muestra en la parte coomassie de la transferencia. Dcr-2 solo se une y se puede eluir, mientras que X solo no se une y, por lo tanto, no da señal. Dcr-2 y X juntos dan dos bandas, sind Dcr-2 se une a las perlas y X interactúa con Dcr-2.

Esta unión también se muestra con el anticuerpo anti-His que solo reconoce la Proteína X. La proteína aparece en la entrada donde se agrega X. También aparece en el carril de elución (donde también está presente Dcr-2) y muestra que X es un compañero de interacción para Dcr-2.