Estoy tratando de descubrir cómo identificar qué proteína en una mezcla compleja está produciendo un efecto determinado.
Hay un ensayo para el efecto, por lo que cualquier cosa (una fracción de la mezcla) puede probarse en una microplaca. La parte de la mezcla que produce el efecto es definitivamente una proteína (o tiene un componente proteico).
Desafortunadamente, la mezcla es suero... que contiene más de 10.000 proteínas y péptidos, algunos en pequeñas cantidades y otros en cantidades enormes.
No hay suficiente información para hacer lo contrario, es decir, adivinar qué está produciendo el efecto y probarlo por sí mismo (o eliminarlo del suero y probar el suero agotado como confirmación).
Tampoco existe la posibilidad de utilizar la afinidad (utilizar un receptor como cebo, etc.) porque muchos componentes del suero se adhieren a las células del ensayo (o, prácticamente, a cualquier célula).
Necesito una forma de reducir esto de "suero" a una proteína específica (o un puñado), pero ¿cómo?
Este es un problema clásico de purificación de proteínas: debe encontrar formas de fraccionar su mezcla para que cada fracción pueda analizarse para la actividad que le interesa. Cuando encuentre la fracción activa, la someterá a un tipo diferente de fraccionamiento.
salando
La solubilidad de las proteínas se ve afectada por la fuerza iónica del tampón. Si la fuerza iónica se eleva por encima de un valor crítico (que es una característica de una proteína individual), la proteína precipitará, normalmente sin desnaturalizarse. Haciendo una serie de precipitaciones de este tipo con fuerzas iónicas crecientes, se puede fraccionar una mezcla de proteínas de acuerdo con esta propiedad. La sal utilizada es sulfato de amonio, por su muy alta solubilidad. Puede encontrar más detalles en esta página de Wikipedia ( precipitación de sulfato de amonio ).
Cromatografía de intercambio de iones
Las proteínas tienen diferentes cargas intrínsecas y la carga neta de una proteína variará con el pH. Esta propiedad se aprovecha en la cromatografía de intercambio iónico.. En esta técnica, la mezcla de proteínas interactúa con una matriz sólida que lleva cargas fijas. Bajo las condiciones correctas, su proteína y otras se unirán a la matriz, mientras que muchas otras proteínas no lo harán. Eso ya es un paso de purificación, pero luego puede tratar la matriz con tampones de fuerza iónica creciente. Las proteínas unidas débilmente se eluyen primero de la matriz y, a medida que aumenta la fuerza iónica del tampón de elución, las proteínas se eluyen en orden de fuerza de interacción. Al realizar este procedimiento con la matriz en forma de columna de cromatografía y recolectar las fracciones de eluato, puede lograr otro paso en la purificación de su proteína.
Cromatografía de exclusión por tamaño (filtración en gel)
Esta técnica se utiliza para fraccionar una mezcla de moléculas según su tamaño. En este caso la matriz sólida que se utiliza se caracteriza por poros de un tamaño específico. Las proteínas que son demasiado grandes para entrar en los poros pasarán rápidamente; las proteínas pequeñas pasarán mucho tiempo entrando y saliendo de los poros y, por lo tanto, pasarán lentamente; y las proteínas de tamaño intermedio pasarán algún tiempo en los poros. Esencialmente, el tiempo promedio empleado en atravesar la matriz dependerá del tamaño. Lea más aquí .
Estos son solo tres de los posibles procedimientos de fraccionamiento; aquí se describen otros, incluida la cromatografía de interacción hidrofóbica ). El punto clave a comprender es que el uso de cualquiera de estas técnicas le dará su proteína en una fracción que también contiene otras proteínas, pero si las aplica secuencialmente, eliminará progresivamente los contaminantes porque cada enfoque se basa en una propiedad física diferente de las proteínas. , y su objetivo tendrá una combinación única de estas propiedades.
En cada paso, analizará fracciones para localizar la proteína de interés y también ejecutará fracciones en SDS-PAGE para tener una idea de la cantidad de proteínas que quedan. Si tiene un ensayo que se presta a medir algún tipo de unidad de actividad (como lo haría con una enzima), al medir también el contenido de proteína de la fracción activa puede expresar la pureza como una actividad específica (unidades de actividad por mg de proteína). En cada paso de su purificación, esta actividad específica debe aumentar porque recupera la mayor parte de la actividad, pero descarta muchas de las proteínas que estaban presentes en el material anterior. El aumento de la actividad específica se puede utilizar para asignar un factor de purificacióna cada paso. Un paso de purificación útil dará un rendimiento razonable en combinación con una purificación significativa.
Finalmente, ¿en qué orden hacer estos pasos? Los he enumerado en un orden lógico: la precipitación con sal es un método de baja tecnología que puede dar un primer paso rápido y que tiene la ventaja de que concentra la proteína objetivo (ya que el precipitado se vuelve a disolver en un tampón nuevo). La cromatografía de exclusión por tamaño no trata bien con grandes cantidades de proteína, por lo que es mejor dejarla para más tarde. Sin embargo, la purificación de proteínas es un oficio y un experto utilizará las técnicas disponibles de acuerdo con la naturaleza exacta del proyecto.
ACTUALIZAR
Por el tono de su pregunta original, había inferido que era un principiante, pero por sus comentarios aparentemente no, ya que está pensando en términos de espectrometría de masas como punto final. Una concentración inicial de pg/mL es todo un desafío, y claramente nunca tendrá suficiente material para ver su molécula en geles estándar.
Aquí hay un par de pensamientos sobre aspectos de su problema.
Parece que al tratar de purificar los componentes menores del suero, un buen punto de partida es agotar el suero de sus proteínas principales. Este es un enlace a un producto de inmunodepleción , y aquí hay un producto relacionado de Biorad (sin conexión con ninguna de las compañías y sin recomendación implícita).
También encontré estos documentos que pueden ser de interés. (Por cierto, creo que encontrará que cada una de las técnicas que describí todavía se usa, tal vez solo con instrumentación moderna).
Finalmente, una mirada rápida a la página de Wikipedia sobre el plasma revela que el péptido natriurético cerebral parece estar presente en los niveles que usted está considerando, tal vez debería buscar documentos que describan su purificación.
Aparte de eso, creo que debe esperar que venga un experto en proteómica y le dé una respuesta experta.
WYSIWYG
usuario560
alex yo