¿La urea en diferentes concentraciones (5 o 0,5 M) tiene efectos diferentes sobre las proteínas?

El problema es explicar por qué cada aditivo da lugar a la distribución de la proteína (RMAS) como se muestra en el golpe occidental a continuación:

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En cada caso, los homogeneizados se sometieron a centrifugación a alta velocidad y las fracciones de sobrenadante/pellet se resolvieron por separado mediante electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS. Los geles se transfirieron y sondearon con un anticuerpo producido contra RMAS.

Estoy específicamente atascado en explicar el efecto de la urea 0,5 M frente a la urea 5 M en las proteínas solubles e insolubles representadas por el sedimento y el sobrenadante, respectivamente. Mi opinión es que a bajas concentraciones de urea (0,5 M), la urea desestabiliza la proteína del sedimento y aumenta la solubilidad mostrando una banda. Sin embargo, las proteínas solubles se desnaturalizan y no muestran banda. Sin embargo, con urea 5M, las proteínas del sedimento son reversiblemente solubles y, por lo tanto, no se muestran como una banda, mientras que las proteínas solubles están bien y, por lo tanto, muestran una banda "normal". No sé si esta es la explicación correcta, ¿alguien podría explicarme por favor?

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Lo que debe hacer es comparar las cantidades relativas de la proteína en la fracción insoluble (pellet) con la soluble (sobrenadante). De esta forma se puede determinar qué tan soluble se ha vuelto el RMAS por efecto del compuesto indicado.

DTT rompe los enlaces disulfuro, pero no hace nada más para solubilizar la proteína, por lo que está todo en el sedimento, sin que se detecte nada en el super. NaCl es una sal que aumenta la "fuerza" iónica del tampón de lisis, pero en realidad no hace nada para solubilizar la proteína, por lo que nuevamente todo el objetivo permanece en el sedimento. Por otro lado, los detergentes como Triton y SDS liberan la proteína de la fracción insoluble y mueven la mayor parte hacia el sobrenadante, lo que lleva al patrón que ves en ellos. Dependiendo de la ubicación subcelular exacta de la proteína de interés y de la cantidad y combinación de detergente(s) utilizada, es posible que no vea ninguna proteína en el gránulo, ya que se ha solubilizado.

La urea y el clorhidrato de guanidinio son agentes caotrópicos que interrumpen los enlaces de hidrógeno, las fuerzas de van der Waals y debilitan las asociaciones hidrofóbicas, lo que hace que la proteína se desnaturalice y se separe de otras proteínas en el gránulo, lo que la coloca en el super. Este efecto generalmente se observa en molaridades relativamente altas (p. ej., GuHCl se usa a menudo en el rango de 6-8 M), lo que explica la diferencia en el efecto que se observa con 0,5 y 5 M de urea. A bajas concentraciones, simplemente no hay suficiente urea presente para desnaturalizar efectivamente la proteína. Estoy un poco sorprendido de que no haya aparecido nada en el carril 0.5 M, sin embargo, esto es solo un western simulado que muestra resultados ideales: en la vida real, las cosas casi nunca son tan cortas y secas.

¿La urea en diferentes concentraciones (5 o 0,5 M) tiene efectos diferentes sobre las proteínas?
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