¿Cómo se puede validar biológicamente una interacción genética de tres vías determinada computacionalmente? ¿Qué tipo de ensayos o pruebas se deben realizar usando modelos basados en células/tejidos y/o ratones para demostrar que los tres genes pueden tener un efecto conjunto?
Digamos que es más fácil identificar y validar interacciones genéticas que involucran factores de transcripción como FOXM1. Considere una interacción genética de tres vías en el cáncer de mama, FOXM1-BUB1-CHEK1, que se puede probar para interacciones directas a través de ensayos de Western blot y reporter. Pero tales interacciones pueden o no ser interesantes, dado que los factores de transcripción pueden estar afectando los niveles de expresión de otros genes. La mayoría de los estudios computacionales se centran en la identificación de interacciones génicas basadas en la coexpresión o la coocurrencia. Existe literatura sobre la identificación computacional de las relaciones AND/OR entre genes que interactúan. No tengo un ejemplo específico para proporcionar pero, por el bien de la discusión, si sospechamos que tres genes están interactuando de una manera similar a AND, ¿cómo validamos biológicamente este hallazgo? YO'
Gracias
Espera, esta respuesta crecerá con el tiempo.
Justo como se me ocurre, creo que podríamos escribir un pequeño libro (o un artículo de revisión muy largo) para cubrir tanto la profundidad como la amplitud de su(s) pregunta(s).
Primero, necesitamos definir y/o aclarar algunos términos. El término interacciónprobablemente signifique diferentes cosas para diferentes autores en diferentes momentos. De hecho, un autor puede usar este término para significar diferentes cosas en diferentes momentos. Así que me gustaría proponer que hagamos algunas distinciones. Por ejemplo, haría una distinción entre una interacción genética entre dos genes (que normalmente se detecta en uno de los organismos modelo, mediante una prueba genética entre dos alelos con pérdida de función) frente a una interacción proteína-proteína (a veces denominada interacción PPI) entre las dos proteínas codificadas por esos mismos dos genes. Los PPI se han detectado clásicamente por co-sedimentación en un gradiente de densidad de sacarosa, o coinmunoprecipitación (co-IP), o por cromatografía de afinidad. Más recientemente, los PPI se han detectado mediante espectrometría de masas (MS) (a veces junto con cromatografía de afinidad). Los PPI se han inferido mediante el uso de ensayos proxy,
Los PPI también se pueden detectar mediante ensayos de resonancia de plasmones superficiales (SPR), y puede haber otros.
Entonces, cuando dices interacciones gen-gen, ¿a qué te refieres exactamente?
Voy a tratar de cubrir tantos escenarios como pueda pensar:
Interacción génica (= coexpresión):
esta es probablemente la más fácil de validar (por ejemplo, mediante transferencia occidental como mencionaste) pero la más difícil de interpretar. Sin más análisis de las funciones de los genes, no tiene idea de qué efecto podría tener su actividad simultánea. Si los genes son enzimas metabólicas o forman parte de una cascada de señales, sería una buena idea comprobar sus funciones individuales en estas vías, pero también comprobar posibles efectos sinérgicos. En principio, lo mismo es cierto para los factores de transcripción, pero en ese caso, las 'vías' a menudo no se entienden igual de bien, en lugar de eso, opte por:
Interacción génica (= en los mismos objetivos):
en el caso de los factores de transcripción (pero también, por ejemplo, quinasas/fosfatasas) que se expresan conjuntamente, puede ser razonable que también afecten a los mismos objetivos. Aquí debe comparar de nuevo ambos efectos individuales (lista de genes regulados hacia arriba/abajo) con efectos sinérgicos (p. ej., el genA impide la función normal del genB, el genC aumenta varias veces la función del genB). Para el análisis del factor de transcripción, generalmente debe analizar la expresión en el nivel de ARNm (a través de qPCR) ya que el nivel de proteína introduce (al menos) otra capa de regulación.
Interacciones de proteínas:
una buena manera de probarlas experimentalmente es mediante experimentos de co-IP (inmunoprecipitación): utiliza un anticuerpo para retener una proteína específica y todos sus socios de unión (directos). Luego muestra la presencia de los socios que le interesan con un western blot.
Una advertencia para este método con interacciones de 3 vías (o de orden superior) es que, dependiendo de la fuerza de unión de las proteínas, puede ser muy difícil evitar que se copurifiquen nada más que los socios de interacción directa. Si desea probar absolutamente que dos proteínas interactúan directamente, un experimento de levadura-2-híbrido (y2h) es más adecuado.
Otros han cubierto mucho más terreno, pero agregaré un par de enfoques desde el lado de la espectroscopia ya que los he estado mirando recientemente.
El transmisor de energía resonante bioluminiscente (BRET) muestra si las proteínas se unen in vivo: "BRET mide la interacción de las proteínas utilizando un donante bioluminiscente fusionado con una proteína de interés y un receptor fluorescente fusionado con su pareja de unión. El donante bioluminiscente, generalmente una luciferasa, no no excita el fluoróforo usando luz, sino que transfiere energía de resonancia a través del acoplamiento dipolo-dipolo. Para transferir energía de resonancia, el donante debe estar dentro de los 10 nm del receptor y en la orientación adecuada, lo que hace que la técnica sea útil para medir proteínas en estrecha proximidad". (De https://www.promega.com/resources/pubhub/features/bret-nanoluc-luciferase-and-protein-protein-interactions/ )
La resonancia de plasmones superficiales (SPR) también muestra si las proteínas se unen, pero in vitro: "SPR es sensible a los cambios en el índice de refracción dentro de aproximadamente 150 nm desde la superficie del sensor. Para estudiar la interacción entre dos socios de unión, un socio se une a la superficie y el otro se pasa sobre la superficie en un flujo continuo de solución de muestra. La respuesta SPR es directamente proporcional al cambio en la concentración de masa cerca de la superficie. Los sistemas Biacore se pueden usar para estudiar interacciones que involucran (en principio) cualquier tipo de molécula , desde candidatos a fármacos orgánicos hasta proteínas, ácidos nucleicos, glicoproteínas e incluso virus y células completas". (Del manual de ensayo de Biacore)
Ambas son formas de ver la interacción directa, es decir, la vinculación. La interacción funcional es una historia completamente diferente.
perry
perry
Coolfunk