¿Se revierten las construcciones de inserción de levadura?

Depende exactamente de lo que hayas hecho.

La forma estándar de usar un plásmido de integración de levadura (YIp) es que se integre en el genoma mediante la recombinación entre un fragmento de ADN de levadura que lleva el YIp y el mismo ADN en el genoma. Este es a menudo, pero no necesariamente, el marcador seleccionable. Entonces, por ejemplo, un YIp que lleva el gen URA3 como su único ADN de levadura se integrará en el locus URA3 (probablemente mutante para permitir la selección de Ura ⁺ , por lo tanto, más correctamente ura3 ).

Si el YIp se linealiza cortando en un sitio dentro del marcador URA3 , esto dirigirá la inserción y aumentará la eficiencia de transformación.

Una vez realizada la inserción, la configuración en el sitio de integración es:

cromosoma...URA3...otras secuencias YIp...ura3...cromosoma

Esto es intrínsecamente inestable porque un evento de bucle de salida puede tener lugar a través de la recombinación entre las regiones URA3/ura3 . Por lo tanto, eliminar la selección significa que corre el riesgo de perder el inserto. Además, es posible que se produzca un bucle dejando atrás el alelo URA3 en lugar del alelo ura3 . Por lo tanto, puede perder el vector incluso cuando se mantiene la selección (pero esto dependerá de la naturaleza exacta de la mutación).

Son posibles configuraciones más complejas donde la secuencia de orientación está separada del marcador seleccionable y donde la digestión elimina una parte completa de la secuencia de orientación antes de la transformación. Entonces, por ejemplo, si el gen TRP1 se usó para apuntar a un plásmido con el marcador URA3 en una cepa TRP1 ura3, obtendría:

cromosoma...TRP1 fragmento A...URA3+otras secuencias YIp...TRP1 fragmento B...cromosoma

el transformante resultante ahora es Ura ⁺ debido al plásmido URA3 integrado , pero ahora falta algo de ADN TRP1 (el ADN que se extirpó cuando se digirió el plásmido), por lo que la cepa es trp1 . La aparición de este fenotipo Trp ^- indica que la transformación probablemente se ha producido por la vía descrita.

En este caso, el plásmido insertado es mucho más estable porque esos dos fragmentos restantes de ADN de TRP1 no son idénticos, por lo que no hay posibilidad de que se produzca un bucle.

En resumen, si su transformante tiene el inserto que lleva el "nuevo gen" flanqueado por una secuencia repetitiva, entonces es inestable; de ​​lo contrario, está bien eliminar la selección. En el primer caso, si el nuevo gen es perjudicial, habrá una fuerte presión selectiva a favor de las células que han perdido el inserto.

Apéndice

Puede evitar el uso de plásmidos YIp por completo integrando su nuevo gen en cualquier locus utilizando cebadores de orientación largos, como se muestra en la figura a continuación.

Diseñe cebadores para amplificar su gen como de costumbre, pero sintetícelos con extensiones 5' de 40 pb correspondientes a dos secuencias en los extremos del sitio de integración (se usa URA3 aquí con fines ilustrativos). El fragmento resultante se puede usar en una transformación y se integrará en el sitio URA3 mediante recombinación homóloga, reemplazando el ADN residente. La ventaja de usar URA3 para esto es que puede seleccionar integrantes como Ura ^- células por resistencia al ácido fluoorótico (FOA). Aunque probablemente pueda seleccionar directamente para esto, siempre he cotransformado el fragmento junto con otro plásmido seleccionable ( LEU2 , TRP1, etc., pero no un plásmido CEN) Entonces, por ejemplo, Leu⁺ los transformantes se pueden seleccionar para aquellos que también se han convertido en FOA ^R . Esta co-transformación ocurre a una frecuencia bastante alta porque las células que toman el ADN toman una gran cantidad. Una vez que elimine la selección para el plásmido de cotransformación, pronto se perderá, dejándolo con un integrante limpio que no se revierte.

Ha pasado un tiempo desde que hice este tipo de cosas; probablemente ahora haya métodos aún más inteligentes.

Se sabe que los plásmidos integradores de levadura son estables, incluso en ausencia de un medio selectivo, pero pueden revertirse como la mayoría de los plásmidos de recombinación homóloga.

Citando del libro Análisis de genes de levadura (pág. 476) :

Los YIps son generalmente más estables que los plásmidos YRp o YEp. Como resultado, es seguro cultivar la mayoría de las cepas portadoras de YIp en medios ricos, aunque es una buena práctica almacenarlas en condiciones selectivas. La estabilidad de las deformaciones portadoras de YIp depende de la naturaleza del evento de integración. Por ejemplo, si el YIp genera una repetición en tándem tras la integración en el genoma, esto puede volver al tipo salvaje mediante un evento de recombinación homóloga intramolecular.

-> por lo tanto, use marcadores con regularidad y frecuencia.

Fuentes :

Mick F. Tuite, Yeast Gene Analysis Vol 26 (Academic Press, 1998) p.476