¿Cómo aislar dos plásmidos de la hebra de E. Coli?

Tengo una línea celular de E. coli que uso para expresar una proteína usando un sistema de dos plásmidos. Uno confiere AmpR y otro KanR.

Para la mutagénesis, me gustaría separar los plásmidos para aumentar la eficiencia de la reacción de PCR mutagénica. Pude curar las células del plásmido KanR porque tiene pocas copias, mientras que AmpR tiene muchas copias, por lo que pude cultivar fácilmente las células solo con ampicilina y terminé solo con el plásmido AmpR. Sin embargo, no pude hacer lo mismo para aislar el plásmido KanR.

Mi siguiente idea fue pasar los plásmidos por un gel y hacer una extracción. Como no hice un resumen, fue muy difícil diferenciar las bandas y terminé obteniendo un rendimiento insignificante. Creo que los plásmidos simplemente se untaron a través del gel debido a las estructuras terciarias.

Mi última esperanza es realizar una digestión de los plásmidos usando una enzima de restricción que corte cada plásmido una vez. Mi preocupación es que no podré obtener la estequiometría correcta debido a que los plásmidos están presentes simultáneamente en concentraciones muy diferentes.

¿Alguien tiene algún consejo sobre cómo podría aislar los plásmidos? ¿O tal vez alguien tiene experiencia ejecutando un resumen de plásmidos con concentraciones desconocidas? Realmente necesito ayuda para hacer esto. El proyecto de mutagénesis ha estado en marcha durante meses y esto ni siquiera es un laboratorio de biología molecular... ¡así que está restando tiempo a los objetivos principales de la investigación!

¿No podría usted digerir con una enzima de restricción que corta el plásmido Amp una (o preferiblemente muchas) veces pero no corta el plásmido Kan? Entonces podrías purificar con gel y transformar el resultado, y presumiblemente sería casi todo Kan
@Luigi Supongo que mi pregunta seguiría siendo ¿cómo funcionaría la estequiometría? Si tengo entre 10 y 50 veces más de un plásmido que de otro, ¿sería eso un problema importante? Supongo que podría hacer una dilución en serie...
Realmente no sé por qué la estequiometría es importante aquí..? Tienes un exceso del plásmido Amp, pero si lo cortas todo, solo te quedará Kan. A menos que no entienda bien tu pregunta
@Luigi Solo quiero decir que cuando configura una digestión o cualquier reacción, prepara los reactivos en ciertas concentraciones. Por ejemplo, para las digestiones dicen una 'unidad' de enzima por microgramo de ADN.
En mi experiencia, siempre que esté dentro de un orden de magnitud con las enzimas de restricción, probablemente esté bien. Dado que Amp está en exceso, probablemente podría operar utilizando la concentración general de ADN y estar bien. Sería más difícil averiguar cuánto usar para digerir el Kan, pero no estoy muy seguro de por qué quieres hacerlo en primer lugar.
La solución de gel es una buena idea, para evitar manchas, intente calentar el miniprep durante 30 minutos a 70 grados centígrados antes de ejecutarlo en un gel.

Respuestas (1)

Una retransformación debería darte un plásmido puro. Transforme la mezcla de plásmidos en E.coli vacío (no use demasiado ADN), coloque en Kan / Amp según lo que necesite. La probabilidad de que una célula absorba ambos plásmidos es extremadamente baja, y puede verificar con la PCR de colonias solo para estar seguro.

De lo contrario: pregunte, debe haber existencias (antiguas) de los plásmidos individuales, o existencias de glicerol de E.coli que contengan solo uno de los plásmidos.

Tercera opción: echa un vistazo a tu método de mutagénesis. Para sus necesidades, puede haber técnicas que funcionen en una mezcla de plásmidos. Si solo necesita una variante o una biblioteca de saturación de un solo sitio, puede usar Quikchange, por ejemplo. No veo una razón por la que esto no funcione en una mezcla de plásmidos.

¿Cómo aislar dos plásmidos de la hebra de E. Coli?
RespuestasAquíPolítica de privacidad1y, 0v