Tengo que aislar un plásmido grande de levadura y transformarlo en E. coli. Después de la transformación, a menudo no obtengo colonias. Una de las razones es que la mini preparación de levadura no ha funcionado o que la concentración de ADN es demasiado baja. Probé dos protocolos de aislamiento diferentes:
Kit de preparación de plásmidos de levadura Zymoprep I
Del documento: "basado en el antiguo método de lisis alcalina de E. coli con nuestra Zymolyase agregada en la primera solución".
Protocolo de aislamiento de fenol cloroformo YAC
utilizado por Dan Gibson et. al] por sus enormes construcciones (>100kb)
Usan una costosa columna Qiagen de construcción grande al final, para purificar y visualizar el extracto de levadura en un gel, pero me salteo ese paso porque la columna Qiagen cuesta $ 40 por clon de levadura, que no escala si hacemos muchos de estas.
¿Cómo puedo solucionar problemas y optimizar los protocolos mencionados anteriormente? ¿Existen otros protocolos que puedan ser más adecuados para un plásmido grande y que no utilicen materiales demasiado caros?
Un protocolo confiable para la extracción de ADN de levadura que solía usar era muy similar a los protocolos que cita, pero incluía una precipitación con etanol antes y después de las extracciones de P:C. El único material caro era el tiempo. El esquema general era:
Probablemente sepa que la tradición de la precipitación con etanol es que el rendimiento es mejor cuanto más largas y frías sean las precipitaciones con etanol. Solo realicé reacciones de transcriptasa inversa unas cuantas veces, pero el ADN molde que preparé pasó la noche en etanol a -80 °C para maximizar el rendimiento. Otro lugar para verificar dos veces es que sus cultivos de levadura sean lo suficientemente densos antes de comenzar.
He usado con éxito el kit Zymoprep, pero solo para plásmidos más pequeños en experimentos de 2 híbridos. Así que su enzima de lisis celular/sistema tampón funciona bien, pero supongo que su plásmido de 42 kb se está precipitando con el ADN genómico.
Las columnas midi estándar de Qiagen son capaces de capturar construcciones grandes. Esto funcionó de maravilla para mí cuando estaba purificando BACmids grandes de E. coli , y reduce el costo a $ 10 / muestra (requiere un búfer adicional, pero ese es un gasto menor). ¿ Valdría la pena probar los protocolos de ADN de levadura de Qiagen para el kit midi y ver si puede aislar su plásmido grande?
Gergana Vandova
yamad