¿La ADN ligasa busca la complementariedad en los extremos cohesivos?

¿Puede la ADN ligasa sellar dos extremos cohesivos no complementarios si la reacción se incuba en las condiciones óptimas? Hago casi el 100% de doble digestión en el laboratorio. Sin embargo, durante la ligadura, cuando realizo un control sin el inserto, sigo obteniendo muchos vectores circularizados y provocan falsos positivos masivos durante la transformación. ¿Puede la ligasa sellar dos extremos adhesivos no complementarios ser una posible razón detrás de esto?

Dado que la ADN ligasa puede ligar el ADN de corte romo, probablemente pueda ligar los extremos cohesivos incorrectos, pero la probabilidad es baja. ¿Está realizando una reacción de fosfatasa antártica para eliminar el fosfato 5' de su vector? Eso reduciría la probabilidad de malas ligaduras.
Desafortunadamente, no estoy haciendo eso porque algunas personas pueden hacer que la clonación funcione sin el tratamiento con fosfatasa en nuestro laboratorio y principalmente sigo sus procedimientos. Al menos hasta ahora.
Definitivamente probaría un control de fosfatasa y vería si ese es el problema.
Es posible que también obtenga falsos positivos debido a una digestión incompleta. ¿Revisaste el plásmido digerido en el gel? También use muy poco del plásmido (≤500ng) en la ligadura
También sospecharía un resumen incompleto. Dependiendo de su método de transformación, unos pocos cientos de plásmidos no digeridos son suficientes para obtener falsos positivos y no los verá en un gel de control. Podría intentar extraer solo la banda de interés de un gel.
Uso alrededor de 300 ng de plásmido para la transformación. Algunos dicen que usan menos, pero lamentablemente no tienen una explicación lógica. En cuanto a la digestión incompleta: también lo he pensado. Sin embargo, dado que los sitios de dos enzimas están muy cerca (solo 31 pb entre los sitios mientras que el vector tiene alrededor de 6 kb) cuando extraigo la banda cortada del gel, también extraigo digeridos individuales y parece que no hay forma de estar seguro. si estoy extrayendo solo los resúmenes dobles o no. Puedo darle una oportunidad al tratamiento con fosfatasa, pero ¿tiene alguna idea sobre la pregunta sobre la ligasa?
Encontraron aquí que la ligasa T4 puede ligar efectivamente los extremos no coincidentes, lo que da como resultado hasta 5 bases no coincidentes. ¿Qué ligasa estás usando?

Respuestas (1)

Si entiendo correctamente, está preparando su vector de clonación digiriéndolo con dos enzimas que están separadas por 31 pb. Si tiene un fondo alto de vector recircularizado, vea si hay un sitio de enzima de restricción único dentro de esos 31 pb. Si lo hay, y si el fragmento que está tratando de insertar también carece de ese sitio, entonces un enfoque simple sería inactivar la ligasa y digerir la reacción con la tercera enzima. Eso debería reducir drásticamente el fondo del vector recircularizado. Si después de purificar con gel el esqueleto del vector después de la doble digestión, obtiene un fondo significativo de recircularización, entonces puede probar fácilmente su hipótesis sobre ligasa ligando extremos cohesivos no coincidentes: ambos sitios de inicio deberían desaparecer y cualquier sitio entre ellos debería haberse ido ¿Has probado esto?

He solucionado el problema aumentando el tiempo de digestión y preparando nuevos platos. Ahora obtengo solo unas pocas colonias cuando no hay inserto, probablemente todavía hay algunos digeridos individuales y la ligasa repara la muesca, y ya no es un problema importante. He leído sobre su sugerencia en otro lugar, pero solo había un sitio de este tipo entre mis sitios y la enzima porque era raro y costoso, así que seguí otro enfoque como mencioné. Aparentemente obtuve falsos positivos porque mis enzimas estaban descuidadas y mis placas estaban un poco viejas.
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