Se necesita aclaración de los procedimientos para amplificar cDNA

El procedimiento típico para obtener ADNc a partir de ADN genómico extraído es el siguiente:

El ARN se extrae del tejido deseado, el híbrido ARN/ADN se obtiene en virtud de la ADN polimerasa dependiente de ARN transcriptasa inversa, la H ARNasa crea lagunas en el ARN del híbrido ADN/ARN y con la ayuda de una ADN polimerasa típica se transcribe el ADN bicatenario, ¿verdad?

Entonces, ¿el ADNc recién sintetizado es lineal (como un "cromosoma pequeño")? ¿Cómo se protege de la actividad nucleolítica? ¿El procedimiento es realmente como el que describí o la transcriptasa inversa ya da un dsDNA a partir de un mRNA monocatenario?

Respuestas (1)

Aquí está el procedimiento aproximado que he usado para preparar cDNA antes

  1. Extraiga el ARN del tejido deseado (seleccione el ARNm usando la cola poliA del ARNm)
  2. Llevar a cabo la transcripción inversa. Esto requiere un cebador complementario a la cola poliA para iniciar la transcriptasa inversa ( Editar : también puede usar cebadores aleatorios para cebar la transcripción inversa. Esto elimina la secuencia poliT redundante del ADNc. Este es el método utilizado en el alto rendimiento de Illumina TruSeq kit de preparación de biblioteca de secuenciación). Ahora tienes una colección de cadenas dobles de ARN/ADN híbrido
  3. Digerir la hebra de ARN específicamente. Esto se puede lograr con RNAsa H como mencionas, o introduciendo condiciones básicas, que degradan el ARN mucho más rápidamente que el ADN debido al 2'OH del ARN. Ahora tiene ssDNA lineal complementario a las plantillas de mRNA iniciales.
  4. A partir de este punto, sus aplicaciones pueden diferir. Si está haciendo micromatrices, todo lo que necesita es ssDNA, ya que desea hibridar el ADNc con la matriz. Si su uso posterior del cDNA requiere dsDNA, entonces necesita sintetizar una hebra complementaria al cDNA (y potencialmente amplificar el producto). Esto se puede lograr a través de cebadores aleatorios de PCR, o alguna PCR más complicada que incorporará secuencias adicionales en cualquier lado de su ADNc (por ejemplo, códigos de barras y adaptadores en RNA-Seq).

¿Cómo se protege [el ADNc] de la actividad nucleolítica?

Si está digiriendo el producto de la transcripción inversa con ARNasa H, esa enzima digiere el ARN específicamente, por lo que su ADN no se daña. Si va a realizar un tratamiento en condiciones alcalinas, entonces el ARN se degradará en esas condiciones mucho más rápido que el ADN debido a la presencia del grupo 2' OH en el ARN que puede actuar como nucleófilo para una reacción de autoescisión.

Entonces, ¿el cDNA tendrá una cola poliT?
Eso depende. Si solo tiene una hebra y la imprima con colas de poliA, entonces sí. Sin embargo, si sintetiza una segunda hebra, tendrá una hebra doble con un lado poliA y un lado poliT. También busqué cómo el kit de preparación de la biblioteca Illumina TruSeq hace esto, y usan cebadores aleatorios para preparar la transcriptasa inversa, por lo que si lo hiciera, no necesariamente tendría una cola poliT en su primera cadena de ADNc. Esto tiene sentido si desea maximizar la cantidad de cDNA informativo (es decir, no poliA/T), por ejemplo, para RNA-Seq.
Se necesita aclaración de los procedimientos para amplificar cDNA
RespuestasAquíPolítica de privacidad1y, 0v