No sé si este es el lugar correcto para hacer esta pregunta, pero me he dado cuenta de que los protocolos para la extracción de ADN de organismos fotosintéticos no usan fenol. Solo CTAB / Cloroformo.
¿Por qué?
Porque la extracción bacteriana o animal está basada en fenol:cloroformo.
Gracias
CTAB es para eliminar polifenoles y polisacáridos que se encuentran en los tejidos vegetales. Las células animales/bacterias no las tienen. Si lo desea, puede realizar una extracción adicional con fenol-cloroformo.
Ver este protocolo de Monsanto.
Pesar 6 g de tejido procesado en un tubo cónico de 50 ml apropiado para centrifugación. Nota: Para el tejido sin procesar, el pesaje puede ocurrir antes del procesamiento, siempre que la muestra procesada completa se transfiera al tubo cónico.
Para cada muestra de 6 g, agregue 25 ml de una solución que consta de 24,25 ml de tampón de extracción CTAB precalentado (55 °C), 0,5 ml de 2-mercaptoetanol (2-ME) y 0,25 ml de 10 mg/ml de proteinasa K para obtener una concentración final. del 2% (2-ME) y 100µg/ml (proteinasa K).
Incubar el tubo durante 60 minutos a 55°C. Enfríe el tubo brevemente en el banco (10 minutos)
Añadir 20 ml de fenol:cloroformo:alcohol isoamílico (PCI, 25:24:1). Tape el tubo y mezcle vigorosamente por vortex o inversión.
Centrifugar durante 10 minutos a 13.000 xg y 20-25 °C para separar las fases acuosa y orgánica. Transfiera la fase acuosa superior a un tubo cónico limpio de 50 ml.
Repita la extracción dos veces para un total de tres extracciones (pasos 4-5).
Transfiera la fase acuosa superior a un tubo nuevo y agregue aproximadamente 2/3 del volumen de isopropanol a -20 °C e invierta suavemente el tubo varias veces para mezclar.
Para precipitar el ADN coloque los tubos a -20°C durante al menos 30 minutos y hasta tres días.
Para sedimentar el ADN, centrifugue los tubos a aproximadamente 13 000 × g durante 20 minutos a 4 °C.
Redisuelva el precipitado en 4 ml de TE pH 8,0. Transfiera a un tubo Sarstedt de 13 ml y agregue aproximadamente 40 µl de 10 mg/ml de ARNasa, luego incube a 37 °C durante 30 minutos.
Para extraer el ADN añadir 4ml de cloroformo:alcohol isoamílico (CIA, 24:1). Centrifugar durante 10 minutos a aproximadamente 13 000 xga temperatura ambiente. Transferir la fase acuosa superior a un tubo Sarstedt limpio.
Repita el paso 11, luego agregue la mitad del volumen de acetato de amonio 7,5 M, mezcle suavemente por inversión/pipeta y agregue 2 volúmenes de etanol al 100 %. Mezcle por inversión/pipeta y colóquelo a -20 °C durante 30 minutos o toda la noche.
Centrifugar a 13 000 × g durante 20 minutos a 4 °C para sedimentar el ADN.
He usado fenol:cloroformo muchas veces para extracciones de ADN y ARN de algas. Estos protocolos solo necesitaban ajustes menores para adaptarlos a una especie en particular (aunque algunas paredes celulares pueden ser extremadamente). El principio general detrás del fenol cloroformo funciona en casi cualquier muestra una vez que haya lisado/pulverizado las células. Los únicos problemas importantes ocurren cuando los tejidos son extremadamente grasos o están llenos de carbohidratos.
También he usado CTAB pero parece ser menos universalmente aplicable a las muestras de algas.