Cada maldito protocolo sugiere agregar DTT al realizar la transcripción de ARN in vitro . ¿Por qué? La razón parece ser que el citoplasma tradicionalmente tiene un entorno reductor, pero como la única proteína que nos importa es la polimerasa T7, ¿por qué es necesaria?
Una búsqueda rápida de cisteínas T7 dio algunas pistas:
La ADN polimerasa inducida por el bacteriófago T7 está compuesta por un complejo 1:1 de proteína del gen 5 inducida por el fago y tiorredoxina de Escherichia coli. La preparación de subunidades activas en ausencia de reactivos de sulfhidrilo indica que la forma reducida de tiorredoxina es suficiente para la formación de la holoenzima activa. La forma oxidada de la tiorredoxina, la tiorredoxina modificada en un sulfhidrilo de sitio activo por yodoacetato o yoduro de metilo, o la tiorredoxina modificada en ambos sulfhidrilos de sitio activo por N-etilmaleimida, son todas inactivas y son defectuosas en la formación de complejos con la proteína del gen 5.
Adler y Modrich, J Biol Chem 258:6956 (1983)
Hay un artículo más reciente ( Aguirre et al, Inorganic Chemistry 48:4425 (2009) ) que menciona " los grupos de sulfhidrilo cisteína críticos de la enzima ", pero desafortunadamente solo tengo acceso al resumen.
Actualización : parece ser un hallazgo antiguo, en lugar de una justificación sobre el estado redox citoplasmático. Según Chamberlin y Ring, JBC 248:2235 (1973) ,
Requisitos generales: los requisitos generales para la síntesis de ARN de T7 dirigida por la ADN polimerasa de T7 se muestran en la Tabla I. Como se esperaba para una polimerasa dirigida por plantilla, la síntesis de ARN muestra un requisito absoluto de ADN, los 4 ribonucleósidos trifosfatos y Mg++.
(No hay sorpresas allí;)
La actividad de la enzima se reduce significativamente si se omite de la reacción un agente reductor de sulfhidrilo tal como b-mercapto-etanol. La adición de p-hidroximercuribenzoato 10^-5 M al sistema de ensayo en ausencia de b-mercaptoetanol eliminó toda actividad, lo que indica que la enzima contiene un grupo sulfhidrilo necesario para la actividad.
Sin embargo, si ve la tabla I, la actividad restante después de eliminar bme sigue siendo del 74%
Parece que hay 7 cisteínas expuestas ( Mukherjee et al, Cell 110:81 (2002) ), pero no pude encontrar ningún documento que discutiera sus funciones.
Siempre supuse que era porque la DTT es útil para inactivar las ribonucleasas (al reducir sus disulfuros) que son notoriamente estables y omnipresentes. Sería bastante desafortunado sintetizar su ARN solo para que una ARNasa contaminante lo destruya de inmediato.
usuario560