¿Cómo se miden las tasas de error de la ADN polimerasa?

Es bien sabido que la primera ADN polimerasa, Taq , es bastante propensa a errores. Las enzimas comerciales de nueva generación que se han aislado de diferentes especies termófilas o se han mejorado mediante recombinación son menos propensas a errores. ¿Cómo se comparan estas tasas de error? Por ejemplo, si esto se hace mediante la secuenciación de Sanger, la señal promedio dominará en la lectura de la salida y, por lo tanto, será muy poco probable que detecte errores con este método.

Los productos Taq podrían clonarse antes de la secuenciación. Sin embargo, sigue siendo complicado, porque el mismo error en dos productos podría representar el mismo error que surge dos veces de novo, o la propagación de un solo error que surgió en una ronda inicial de amplificación.
Es por eso que era escéptico acerca de un enfoque basado en la secuenciación. Supongo que el método descrito por Alan Boyd a continuación es un enfoque funcional, pero esto todavía enmascara mutaciones sinónimas y, por lo tanto, subrepresenta la verdadera tasa de error.

Respuestas (1)

Según su sitio web, New England Biolabs utiliza una versión del enfoque promovido por Wayne Barnes, como se describe en:

Kermekchiev, MB, Tzekov, A y Barnes, WM (2003) Nucl. Ácidos Res. 31, 6139–6147

Básicamente, se trata de un ensayo de la tasa de mutación en un gen lacZ (β-galactosidasa) amplificado por PCR, analizado transformando E. coli , sembrando en placa el sustrato cromogénico de β-galactosidasa Xgal y luego calificando las colonias blancas como genes mutados. También según NEB, Agilent Technologies utiliza un ensayo mutacional similar, pero basado en el gen lacI (represor lac).

Gracias por la referencia. Este parece ser el enfoque más pragmático para este problema. Aunque por diseño, este método subestima la tasa de error, sería un sesgo constante entre las polimerasas.
Es posible que hayan calibrado el ensayo mutacional a un enfoque más riguroso en algún momento, pero solo estoy suponiendo. Como dices, para ellos la fidelidad relativa es más importante que el valor absoluto.
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