PCR no funciona

Estoy tratando de verificar la integración del ADN en una región muy específica del genoma de E. coli, y para eso estoy comparando mediante electroforesis en gel de agarosa al 2,5% la longitud de los productos de PCR de células completas (espero 120 y 242 pb bandas).
Desafortunadamente, las últimas 3 PCR fueron muy infructuosas, o debería decir no interpretables, ya que solo los cebadores no consumidos eran visibles (+ gDNA) y no había amplicones de 120 pb.

Electroforesis en gel ANTES
Esas bandas son amplicones de 120 pb - Q5. Electroforesis en gel DESPUÉSNo confiaría en esas bandas desmayadas - Taq.

La escalera que utilicé es 2-Log 0.1-10 kb.

Aquí también está la receta para una reacción de 25 ul:
- 5 ul de tampón de polimerasa 5X
- 0,5 dNTPs 10 mM
- 0,25 ul de cada cebador 50 uM
- 0,25 ul de polimerasa (probé Q5, Taq y Phusion)
- 1 ul de plantilla (bacterias)
- 17,75 ul H20

¿Qué podría haber salido mal? ¿Estoy malinterpretando los resultados? ¿Estoy agregando demasiado ADN molde? ¿Es posible que las imprimaciones se degraden después de varias heladas? ¿Hay demasiados inhibidores dentro de las bacterias?

Respuestas (3)

Primero, debe verificar que su temperatura de recocido sea adecuada para la temperatura de fusión de sus imprimaciones. (y que los demás parámetros de la PCR, como la temperatura de extensión, sean apropiados para su polimerasa)

En segundo lugar, aunque la mayoría de la gente le dirá que no es necesario, he descubierto que puede ser útil limpiar un poco la plantilla de ADN. Para las bacterias, herviría en agua (colocaría una colonia en 20-30 ul) durante 5-10 minutos, centrifugaría los restos celulares y tomaría 0,5 ul del sobrenadante.

¿Tienes un control positivo? (intenta amplificar alguna otra región del genoma que no hayas modificado)

De sus otras sugerencias, diría que la degradación de la imprimación es increíblemente improbable.

Nadie puede decirte exactamente qué salió mal, verificaría que tus cebadores estén en la secuencia correcta. Puede reordenarlos nuevamente o reordenarlos ligeramente diferentes; Los cebadores son baratos y llegan rápido.

MgCl2 también puede ser la razón. Probé títulos de MgCl2 1.5, 2, 2.5, 3 con todas las demás condiciones iguales y funcionó.

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