¿Cuál sería el método más corto y óptimo para extraer células humanas para PCR? ¿Existe un protocolo similar a la PCR de colonias para células humanas?

Estoy tratando de idear un método rápido para extraer ADN genómico de células humanas para una PCR.

Primero recolecté células centrifugando un enjuague bucal con solución salina (0,9 % de NaCl) y extraje el ADN genómico usando un kit seguido de un protocolo de PCR que funciona bien pero es un proceso bastante largo.

Traté de acortar el método y eliminé los pasos de extracción de ADN mediante el uso de muestras de saliva granulados como plantillas para PCR y aumenté el paso de desnaturalización inicial de 3 minutos a 5 minutos. Sin embargo, este método no era fiable ya que algunas de mis muestras estaban amplificadas y otras no.

¿Alguien puede sugerirme un protocolo confiable aquí?

¡Gracias!

¿Por qué es necesario acortar el protocolo?
Estoy tratando de hacer un protocolo en el que la extracción de ADN, la PCR y la electroforesis en gel se puedan realizar en un período de tiempo de aproximadamente 4 a 5 horas y estoy tratando de compactar todo.
@techtrix Tengo curiosidad, ¿probaste el método de ebullición?
@RoSiv todavía no. Puedo empezar mi trabajo la próxima semana. Voy a hacerle saber cómo resulta.

Respuestas (2)

No confío en mi respuesta, pero el artículo vinculado a continuación tiene métodos para la extracción de ADN de varios tipos de muestras humanas (sangre, cabello, orina, mejilla)

Por lo que vale, mis profesores siempre me dijeron que la extracción de ADN era más un arte que una ciencia, y uno tiene que jugar para hacerlo bien.

Tal vez para algo realmente rápido, podría probar un "tampón aplastante" de protienasa K y luego hervirlo durante unos 10 minutos en el búfer y luego intentar ejecutar PCR. Sin embargo, solo soy un estudiante universitario, así que tome mis palabras con cuidado.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3792701/

Así es como recolectaron las muestras bucales: hisopos bucales:

Se reclutaron cinco voluntarios adultos sanos (rango de edad, 22 a 35 años) y se recopiló información demográfica, incluida la edad, el estado de salud, el sexo, la ascendencia de la población, el color del cabello y los tratamientos para el cabello. Se pidió a los voluntarios reclutados que se enjuagaran la boca con agua del grifo, 30 s antes de la toma de muestras de hisopos bucales, para evitar la contaminación por partículas de alimentos. Para cada individuo, se limpiaron ambos lados de la mucosa bucal con un hisopo de algodón durante 15 s y se recolectó un total de cinco muestras en 500 μl de Tris-HCl 10 M, EDTA 10 mM, SDS al 2 %, que contenían tubos de microcentrífuga de 1,5 ml. . Se realizó el aislamiento de ADN a partir de hisopos de algodón.

Aquí hay un copy paste, los guiones son míos.

Extracción de ADN:

Hisopos bucales:

-las muestras se suspendieron en 500 μl de tampón de lisis [Tris 10 mM (pH 8,0), EDTA 10 mM y SDS al 2,0 %] y 50 μl de SDS al 10 %, seguido de 5–10 μl de proteinasa K 20 mg/ml

-Se incubó de 1 a 3 h a 56 °C hasta que el tejido se disolvió por completo.

-Luego se extrajo el ADN de cada muestra con un volumen igual de solución de fenol:cloroformo:alcohol isoamílico (25:24:1) y se mezcló suavemente invirtiendo los tubos durante 3 min.

-Luego, las muestras se centrifugaron (Eppendorf 5415R; Hamburgo, Alemania) durante 10 min con 10 000 g (4 °C),

-La capa acuosa superior se transfirió a un tubo de microcentrífuga nuevo y esterilizado.

Se añadió -RNasa A (10 μl de 10 mg/ml; Fermentas, Thermo Scientific, Alemania) y la solución se incubó a 37°C durante 30 min.

-Se añadieron volúmenes iguales de solución de cloroformo:alcohol isoamílico y se centrifugaron (Eppendorf 5415R), nuevamente con 10.000 g (4°C) durante 10 min.

-La capa acuosa superior se transfirió a un tubo de microcentrífuga esterilizado y se añadió el doble del volumen de isopropanol enfriado (Merck, Whitehouse Station, NJ, EE. UU.), junto con una décima parte del volumen de acetato de sodio 3 M, y se enfrió a -20 °C durante 1 h para la precipitación.

-Después de 1 h, la muestra se centrifugó (Eppendorf 5415R) a 10.000 g (4 °C) durante 10 min.

-Después de decantar el sobrenadante, se añadieron 250 μl de etanol al 70% (Merck) y se disolvió el sedimento; la mezcla se centrifugó a 10.000 rpm durante 10 min y el sobrenadante se decantó suavemente.

- El sedimento se secó al aire bajo un flujo de aire laminar, y el sedimento seco se resuspendió en 50 μl de agua libre de nucleasas o Tris-HCl 1x 10 mM, EDTA 1 mM, pH 7,6 (TE), tampón y se congeló a -20ºC. °C o a -80 °C para el almacenamiento.

Gracias Ro Siv, pero este proceso me parece bastante largo. Sin embargo, podría probar el método de "tampón aplastante" de protienasa K.

¡Hago muchas extracciones de gDNA y cfDNA! Lo que Ro Siv ha explicado es un método bastante estándar de extracción de hisopos bucales, sin embargo, los tiempos de incubación de pK no necesitan ser tan largos. El estándar de oro en la extracción de ADN son los kits de QIAGEN. Específicamente para sus usos, optaría por algo como el kit QIAamp DNA Mini (puede ver los protocolos del manual en su sitio: https://www.qiagen.com/us/resources/resourcedetail?id=67893a91-946f-49b5- 8033-394fa5d752ea&lang=en ) En la práctica, pude hacer 4 muestras sin automatización en su protocolo de centrifugado en alrededor de 1,5 horas en total.

El tiempo de la PCR dependerá de las condiciones de su ciclo y del tiempo que tarde en configurar una reacción, etc., y los geles dependerán de la precisión que necesite que tengan sus bandas. Creo que todo se puede hacer fácilmente en 4-5 horas. En mi experiencia, las muestras de sangre toman solo un poco más de tiempo, pero obviamente son más invasivas y menos prácticas. Estoy de acuerdo en que bucal es el camino a seguir. Como referencia, usamos hisopos hydraflock de Puritan, pero eso depende de usted.

¿Cuál sería el método más corto y óptimo para extraer células humanas para PCR? ¿Existe un protocolo similar a la PCR de colonias para células humanas?
RespuestasAquíPolítica de privacidad1y, 0v