Tengo una mezcla de plásmidos y fragmentos lineales cortos no deseados que comparten las mismas secuencias. Durante la desnaturalización y el recocido, me gustaría que los plásmidos se 'encontraran' antes de recocer los fragmentos lineales más cortos. Suponiendo que la concentración de fragmentos más cortos sea significativa, ¿existe un perfil de temperatura que sesgue hacia la reasociación de ADN más largo?
Más específicamente, esto es para una variación del ensayo de detección de mutación Surveyor, en el que se digiere el ADN reasociado con desajustes, dejando intacto el ADN no mutante. Me gustaría conservar plásmidos no mutantes para la transformación de E. coli. Sin embargo, algunos fragmentos lineales ~10-50% de la longitud del plásmido han escapado al tratamiento con exonucleasa y competirían con los plásmidos durante la hibridación.
La respuesta corta es que una temperatura más alta favorece el recocido de secuencias más largas. Hay varias formas de calcular la temperatura de fusión, pero todas producen resultados similares: los polímeros más largos requieren más energía térmica para fundirse. Por lo tanto, el enfriamiento rápido desde temperaturas más altas (por ejemplo, desde 95 °C, el termociclador puede enfriarse en 10-12 segundos ) hasta RT/4 °C favorecerá el recocido de las hebras circulares. Un enfriamiento más lento debería permitir que se unan más ssDNA.
Pero nuevamente, si el objetivo final es seleccionar dsDNA circular, la transformación simple debería encargarse de eso.
aaaaa dice reincorporar a Monica
bravotang8
aaaaa dice reincorporar a Monica
bravotang8