Retraso de la PCR en tiempo real en Cq debido a la inserción de SNP en el cebador

Estoy recopilando evidencia, incluso anecdótica, de cómo la eliminación o inserción de un solo nucleótido en la región del cebador afecta el resultado de la PCR en tiempo real. Lo que más me interesa es cuánto hay de retraso en Cq (valor de ciclo de umbral) si se compara con un cebador perfectamente combinado. Pero si no tiene datos de Cq, también recopilo respuestas de "Sí o No", diciendo si hubo amplificación o no.

Estoy interesado específicamente en los desajustes de inserción o eliminación. (Para los desajustes de sustitución, hay muchos datos).

Agradeceré cualquier evidencia publicada o no publicada.

¿dónde está la inserción desde el extremo 3'? La eficiencia del cebador se verá afectada si se introducen indeles puntuales. Si hay una discrepancia en el extremo 3', es posible que la extensión no ocurra en absoluto. En cuanto a los datos, nadie diseñará deliberadamente un iniciador RT con discrepancias a menos que estén investigando sobre la eficiencia del iniciador. :P
La inserción está en la posición 9 desde el extremo 3' y la longitud del cebador es 19. El cebador fue diseñado para distinguir 2 especies de plantas relacionadas, se suponía que una debía amplificarse, mientras que la otra no debería amplificarse debido a la falta de coincidencia de la inserción. Creo que los autores están equivocados y que una eliminación en tal posición no es suficiente para discriminar especies. Pero le estoy pidiendo a la gente datos empíricos, posiblemente algo que pueda citar.
Esta pregunta está relacionada con la anterior ( biology.stackexchange.com/questions/14357/… ), pero ahora es un poco diferente. Antes pregunté sobre la temperatura de fusión, pero ahora sé que el retraso del valor de Cq es el parámetro que estoy buscando (y no está correlacionado con Tm).
no puede distinguir entre especies con precisión si su desajuste de puntos está dentro del manual. La secuenciación es lo mejor que puede hacer, pero debe usar un cebador que se une aguas arriba de la región variable. La eficiencia del cebador cambiará con la falta de coincidencia, lo que a su vez afectará el valor de Ct, pero no existe una correlación directa entre la falta de coincidencia y Ct.
@ WYSIWYG Ejemplo de discriminación entre nueces y pecanas por 4 desajustes en el cebador inverso. Estudio reciente sobre varias correlaciones entre el número de desajustes y delta Ct (y otras correlaciones de otros parámetros). No espero un estudio igualmente profundo sobre los desajustes de eliminación, solo estoy recopilando evidencia anecdótica.

Respuestas (1)

Como señaló @WYSIWYG, tener la diferencia indel en el extremo 3 ' puede ser informativo , pero me resulta más difícil encontrar evidencia en el medio de la cartilla. Poner la mutación/indel en el extremo 3' cambiará el ΔCT. Para hacerlo bien , necesita una amplia cobertura en su sitio de mutación.

Creo que es posible que haya una diferencia con un desajuste en el medio de una cartilla, pero no sería tan obvio como si estuviera más cerca del extremo 3 '. A menos que hubiera alguna razón seria por la que no pudiera ponerlo allí (es decir, Tm por debajo de 45 en la referencia), eso suena como un diseño de imprimación deficiente.

Notaré que ciertamente no soy un experto en qPCR, y no creo que la pregunta haya sido investigada directamente (como supuso). Nuevamente, cuando busqué Indels antes (estaba haciendo algunas cosas interesantes con los tipos HLA...) usamos cebadores más grandes para la qPCR.

Si esto no responde satisfactoriamente a su pregunta, ¿hay alguna referencia inicial que desee que examinemos? Me imagino que cosas como una buena extinción y otros factores podrían tener algún significado al comparar dos plantillas (una con indel y otra sin), pero de nuevo, es un poco extraño poner la mutación en el medio.

Editar a los comentarios: 1: Creo que el retraso de Cq dependerá de cosas como la longitud, la secuencia y la mutación. Puede haber una fórmula/algoritmo de gran esquema para predecir el retraso, pero no conozco uno, y no pude encontrarlo si existe. La mayoría de los gráficos y las diferencias que he visto han sido lo suficientemente grandes como para convencerme de que eran significativos. No sé si esto es como un flujo en el que te puedes sentar y discutir todo el día sobre la relevancia biológica del 40% al 30% de un grupo en particular.

2: Lo siento, no tuve tiempo de entrar y dar un resumen adecuado de ellos. Son, como usted señaló, tangenciales a lo que está tratando de hacer, pero de hecho abordan el problema a través de sus métodos. Intentaré hacer un mejor verano cuando tenga tiempo (tengo una subvención que estoy tratando de terminar para el martes, así que probablemente después de eso). Si tiene alguna aclaración a la pregunta para agregar, por favor hágalo.

3: Esto puede haber surgido de la percepción general de que era necesario, y que apunto a la Tm más alta que generalmente puedo manejar sin que se introduzcan problemas de estructura. También tengo el lujo de no tener que preocuparme por el costo de los ulta-mers. También podría haber venido de la historia de trabajo en BAC hace años. Los cebadores más largos siempre aumentaron mis tasas de éxito cuando estaba eliminando casetes.

Solo pensé que a veces debe suceder que se diseñe el manual sin conocer todas las variantes posibles del gen objetivo. Y a veces, creo, se descubre accidentalmente que hay una eliminación o inserción de un solo nucleótido entre el cebador y la variante (alelo) de la plantilla. Esperaba que alguien se encontrara con algo como esto durante su trabajo y pudiera decirme cuánto se retrasó Cq. (O, en la configuración de PCR clásica, si hubo amplificación o no). Los artículos que me señaló parecen relevantes, aunque no responden exactamente a mi pregunta.
Sabes, no tengo tiempo para leer todos los artículos antes de que expire mi recompensa. No parecen responder exactamente a mi pregunta, pero son relevantes y no pude encontrarlos antes. Y no quiero desperdiciar la recompensa... Así que deja que sea tuyo, pero es posible que me veas haciendo la misma pregunta de otra manera más adelante. Lo que debería hacer de todos modos, porque la mayoría de la gente parece estar confundida por eso.
¿Cómo supo que necesita usar cebadores más grandes, cuando está introduciendo una mutación puntual tipo indel? ¿De dónde viene esa recomendación original?
@Barbara lo siento, acabo de iniciar sesión y noté tus comentarios. Intenté al menos abordar sus comentarios de alguna manera. Tendré que volver para abordarlos más a medida que tenga tiempo.
1. "No sé si esto es como un flujo en el que te puedes sentar y discutir todo el día sobre la relevancia biológica del 40% al 30% de un grupo en particular". - No entendí esta frase. 2. "Lo siento, no tuve tiempo de entrar y dar un resumen adecuado de ellos" - No quise decir que era su responsabilidad resumir (¿debería uno hacerlo en este sitio?), resumir seguramente ayuda, pero Estoy muy agradecido por las citas en bruto.
@Barbara re:1, digamos que tiene un cambio repetible del 5 al 15 % en una población mediante citometría de flujo. Sin duda, puede alcanzar la significación estadística mediante grandes adquisiciones y muchas réplicas, pero dependiendo de los antecedentes biológicos, esto puede o no ser biológicamente significativo/relevante.
Bien, gracias por la explicación. Ese no es el tipo de trabajo que estoy haciendo. Es más como si necesitara determinar mediante PCR cualitativa en tiempo real, si el chocolate contiene trazas de nuez o pecana.
Retraso de la PCR en tiempo real en Cq debido a la inserción de SNP en el cebador
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