¿La cantidad de dNTP limita la velocidad de los productos de PCR muy largos?

Estoy usando el sistema Q5 y ​​estoy PCRing un producto que tendrá una longitud final de alrededor de 9500 bases. He notado que el producto está ahí pero muy tenue. La imprimación parece estar agotada.

Entonces, mi pregunta es, ¿pueden los dNTP limitar la velocidad en una reacción larga? Es decir, ¿pueden usarse todos los dNTP en los primeros ciclos de PCR y tal vez no estar disponibles para las rondas exponenciales posteriores?

Parece que tiene alrededor de 1000 veces la cantidad de dNTP en comparación con la cantidad de cebador (200 µM en comparación con 0,2 µM). Así que tal vez... o mi química básica está mal. ¿Alguna precedencia?

IIRC Q5 requiere 0,5 µM de cada imprimación como se menciona en la documentación. En cualquier caso, ¿por qué no agregar más dNTP si sospecha que esa es la causa?
Estoy haciendo eso ahora. Pero como cualquier cosa en Biología, estoy seguro de que hay consecuencias por agregar demasiado.
Agregue controles en caso de duda
Sí, es posible. Los dNTP también pueden degradarse a altas temperaturas. Por eso se añaden en exceso. Puede agregar más y, siempre que no esté realizando una PCR en tiempo real, no se preocupe demasiado por las bandas difusas/múltiples. Siempre puedes hacer una re-PCR.
Agregar demasiados dNTP puede causar problemas. Se unen al magnesio del tampón de reacción, por lo que si va a aumentar drásticamente la cantidad de dNTP, tendrá que optimizar la reacción nuevamente para el magnesio.

Respuestas (1)

200 uM de dNTP en 50 ul de mezcla de reacción podrían producir más de 10 ug de ADN si se consumieran todos los dNTP, independientemente de la longitud de los productos de PCR. Puede detectar fragmentos de ADN de tan solo 5 ng mediante electroforesis convencional utilizando EtBr. Probablemente podría ver una banda clara cuando carga más de 100 ng de un fragmento de ADN. Por lo tanto, no me preocupa mucho la concentración de dNTP.

Cuanto más tiempo amplifique los productos de PCR, más difícil será amplificar. Entonces es posible que no obtenga suficiente eficiencia para detectar sus productos de PCR. Es posible que desee probar una temperatura de recocido más baja si no obtiene bandas no específicas con o sin algunos aditivos como DMSO, betain, etc., o si usa enzimas más fuertes. También la PCR de contacto puede ser útil para obtener bandas específicas de manera eficiente.

Cuando aumenta la concentración de dNTP, los efectos de Mg ++ pueden silenciarse porque dNTP podría quelar Mg ++ como Chris mencionó en la columna de comentarios.

¿Qué quieres decir con "enzima más fuerte"? Q5 es una de las mejores (si no la) mejor ADN polimerasa comercialmente disponible.
Oh, lo siento, me perdí esa parte... Por supuesto, Q5 es uno de los más fuertes. Pero eso no significa que otras enzimas no sean útiles. Aún así, tiene la oportunidad de obtener más fragmentos de PCR mediante otras enzimas como primestar.
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