¿Cuáles son los problemas de usar un ssDNA o un mRNA para la expresión en lugar de usar un plásmido?

Digamos que quieres hacer un experimento de clonación de genes. Tiene un vector de expresión vacío (ARNm o ADN) y desea clonar algún gen X en él. ¿Por qué solo se puede comprar X dentro de un vector (que a su vez suele estar dentro de un portador bacteriano)?

¿Cuál es el problema con el manejo de nucleótidos de ARNm puro del gen X? ¿O incluso sscDNA?

Los plásmidos son vectores. El gen insertado se denomina clon o simplemente un inserto que porta el vector.,
@WYSIWYG No, los vectores son vectores, los plásmidos son plásmidos, en algunos casos, los plásmidos son vectores. Pero, literalmente, un plásmido es solo un trozo de ADN.
Me refiero a los plásmidos utilizados en biología molecular, no a los plásmidos naturales.

Respuestas (1)

¿Cuál es el problema con el manejo de nucleótidos de ARNm puro del gen X? ¿O incluso sscDNA?

Problemas al transfectar directamente un mRNA/ssDNA

Los ARNm se pueden transfectar en las células y se hace con bastante frecuencia. El problema con la transfección directa de ARNm es que el ARNm se degrada pronto y no tendrá una expresión sostenida. Sin embargo, esto es muy útil en ciertos casos, como la creación de células madre pleuripotentes inducidas (iPSC), donde no desea que las células expresen continuamente los factores de Yamanaka (algunos de los cuales también son oncogenes).

Además, los ARN como tales son bastante susceptibles a la degradación. Es mucho más fácil preparar y almacenar soluciones de ADN durante mucho tiempo.

Problemas similares surgen con un ssDNA.

¿Por qué solo se puede comprar X dentro de un vector (que a su vez suele estar dentro de un portador bacteriano)?

Una gran ventaja del uso de plásmidos es que puedes propagar tu gen infinitamente. Si, en cambio, le dieron una cantidad fija de ARNm, pronto se le acabará. Algunos vendedores practican políticas capitalistas tan codiciosas: P

Cuando está amplificando un ADN mediante PCR, la clonación tiene ventajas adicionales:

  • puede secuenciar el gen usando cebadores bien estandarizados (como T7)
  • puedes hacer construcciones que pueden expresar el gen condicionalmente

Tiene un vector de expresión vacío (ARNm o ADN) y desea clonar algún gen X en él.

No puedes clonar fácilmente algo dentro de un ARN. Necesita endonucleasas de ARN específicas. Además, una doble digestión sería desastrosa en este caso.

Por qué los proveedores generalmente no venden un inserto de dsDNA sino que lo proporcionan clonado en un plásmido

  • Un dsDNA circular es más estable
  • Los proveedores pueden conservar el stock del inserto para futuros clientes sin tener que volver a realizar la PCR.
  • El inserto clonado se puede amplificar a través de cultivos bacterianos para obtener cantidades muy altas (preparaciones maxi/giga)
Estaba pensando desde una perspectiva de flujo de trabajo. Cuando compra un plásmido (generalmente ADN de doble cadena en una bacteria), primero debe extraer el plásmido, luego cortar el ORF, luego amplificar y ligar el extracto de ORF a su propio vector. ¿Por qué no venden viales de ORF? Eso también debería ser fácil de autopropagarse.
@jiggunjer No, generalmente no compras el cultivo bacteriano que lleva el plásmido. Solo obtienes el plásmido disuelto en Tris-Cl pH 7.5. El ADN lineal que contiene solo los ORF no puede propagarse por sí mismo. Puede PCR una pieza de ADN, pero con cultivos bacterianos puede obtener una gran cantidad de ADN (preparaciones maxi/giga). El ADN circular también es relativamente más estable.
Incluso si uno obtiene un plásmido puro, ¿por qué no un ORF puro? Admito que el argumento "no circular es menos estable" suena bastante convincente. Sé que no pueden auto propagarse, pero por eso mencioné el vector vacío. Así que solo compre ORF, PCR y ligue. No tengo mucha experiencia en el laboratorio, pero estoy tratando de dominar el protocolo, parece innecesariamente laborioso.
@jiggunjer Obtienes un vector vacío sin ninguna inserción. Algunos proveedores también venden un vector predigerido/linealizado.
Los proveedores de @jiggunjer no venden insertos predigeridos porque no hay un vector estándar. Diferentes vectores tienen diferentes sitios de expresión, que requieren diferentes enzimas de restricción para clonar. La venta de ORF significaría que el proveedor tendría que mantener existencias para cientos de tipos diferentes de combinaciones de extremos cohesivos/recombinasa. Es mucho más fácil para el usuario final PCR el fragmento y subclonarlo.
¿Cuáles son los problemas de usar un ssDNA o un mRNA para la expresión en lugar de usar un plásmido?
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