Me da un poco de vergüenza preguntar, pero cuando tiene, por ejemplo, cuatro cebadores degenerados y el protocolo final dice que la concentración final del cebador debe ser de 10 µM de stock de trabajo, ¿debería hacer que los cebadores tengan un total de 10 µM (2,5 µM cada uno) o 10 µM para cada cartilla degenerada?
Simplemente puede agregar 2 µl de cada stock de trabajo (10 µM) a su mezcla de PCR de 20 µl.
Puedes consultar este protocolo.
Precaución : el autor ha utilizado
en lugar de
Utiliza 5 µl de cada cebador (20 µM) en una reacción de 50 µl. Esto es el doble de lo que mencioné. En mi opinión, es mejor probar con una concentración más baja y luego aumentarla si es necesario. El exceso de concentración de cebadores puede dar lugar a una unión y amplificación inespecíficas si los cebadores no están perfectamente diseñados.
Desde este sitio:
Uso de cebadores degenerados
Debido a que un cebador degenerado es en realidad una mezcla de diferentes cebadores, solo una fracción del "cebador" degenerado funcionará realmente en la PCR. Por lo tanto, sería necesario aumentar la concentración de cebador en PCR, reacciones de secuenciación, etc. Si un cebador tiene una degeneración de 8 veces, la concentración debe aumentarse de 4 a 8 veces, y así sucesivamente. Sin embargo, para degeneraciones más altas, por ejemplo, 64 veces, no se puede aumentar la concentración del cebador 64 veces y tendría que probar suerte con un aumento de 5 a 10 veces solamente.