Estoy buscando una cepa de E coli altamente competente. Estoy haciendo una biblioteca de un plásmido de ~6.6kb y no estoy obteniendo una eficiencia lo suficientemente alta. ¿Alguien tiene alguna sugerencia de una cepa/protocolo con eficiencia ultraalta (>10 10 ).
Esta es una gran pregunta ya que acabo de hacer mis propias células químicamente competentes "caseras".
Hay una gran variedad de cepas de E. coli que se usan comúnmente para la clonación. Pueden ser transformados químicamente por el método de choque térmico, o eléctricamente por electroporación (puede encontrar un breve resumen aquí ). Estos pueden hacerse en el laboratorio manualmente o comprarse comercialmente a proveedores acreditados (recomiendo Invitrogen/Life Tech, NEB, Promega).
La competencia química se logra usando el método de Hanahan o alguna variación del mismo. El método consiste en lavar las bacterias en una serie de tampones que contienen varias sales de cloruro de cationes divalentes (CaCl 2 , RbCl 2 , etc.). La E. coli comercialmente disponible se vende como "regular" y "ultra" competente, con un rango de 10 6 a 10 6 para regular, y la más alta que he visto es 10 10 ufc/µg de ADN. Para obtener la máxima eficiencia, especialmente porque un plásmido pequeño como el suyo será fácil de transformar, la electroporación es una técnica más eficiente, pero requiere un equipo especializado . La electroporación puede producir >1010 ufc/µg . Para las prácticas estándar de clonación, la E. coli regular o de alta eficiencia químicamente competente es perfectamente adecuada. Como mencionó que está creando una biblioteca, sin duda desea optar por una transformación química de ultra alta eficiencia o, si tiene el equipo necesario, por electroporación. No he visto eficiencias de electroporación reportadas > 5x10 10 .
Las eficiencias de transformación se estandarizan informando una tasa como el número de unidades formadoras de colonias (cfu) por µg de algún plásmido de control, típicamente pUC19. La eficiencia de transformación es muy sensible a muchos factores, incluidos el tiempo de choque térmico, los tiempos de enfriamiento, el tiempo de descongelación, la cantidad y el tamaño del ADN plasmídico. En igualdad de condiciones, el tamaño y la cantidad de ADN son importantes para sus propósitos. La eficiencia de transformación generalmente aumenta con la cantidad de ADN, pero hay un punto de saturación y, eventualmente, tener demasiado ADN disminuye el rendimiento. Además, la eficiencia disminuye linealmente con el tamaño del plásmido. Por ejemplo, pUC19, el vector de control, tiene ~2,7 kbp y el plásmido de su biblioteca tiene ~6,6 kbp, por lo que debe esperar que para la misma masa de ADN haya perdido un 60 % de transformación debido al tamaño del plásmido.
He oído que las células electrocompetentes Epi300 ( 1 ) de Epicenter son muy eficientes: > 1 x 10 10 ufc/µg de pUC19. Dan Gibson los utilizó en su artículo para la síntesis del genoma mitocondrial ( 2 ). También pensábamos utilizarlos para nuestros montajes, pero son bastante caros.
1. E. coli electrocompetente TransforMax™ EPI300™
2. Síntesis química del genoma mitocondrial de ratón, Gibson et. Alabama.
usuario560