Clasificación de células activadas magnéticamente frente a FACS

La clasificación de células activadas magnéticamente (descarga de PDF), o MACS, es un procedimiento desarrollado por Miltenyi Biotecpara separar células de mezclas complejas utilizando nanopartículas magnéticas recubiertas de anticuerpos. Los anticuerpos son específicos para determinados marcadores de la superficie celular, ya sea expresados ​​en su población de interés (selección positiva) o expresados ​​en tipos de células no deseados (selección negativa). Después de agregar las perlas recubiertas de anticuerpos a la mezcla de células e incubarlas, la suspensión se agrega a una columna de separación especial de un solo uso fijada a un imán, a la que se adhieren las perlas, mientras fluyen las células sin marcar. Si realiza una selección negativa, el flujo continuo es su población de interés y las perlas y células unidas se descartan. Si sus células de interés están unidas a las perlas (selección positiva), la columna se lava varias veces para asegurarse de que las células no unidas o unidas débilmente se laven completamente.

En la clasificación de células activadas por fluorescencia o FACS, la mezcla celular compleja inicial se marca primero con uno o más anticuerpos específicos de marcadores de superficie celular que se han conjugado con colorantes fluorescentes. También se pueden analizar células que expresan una o más proteínas fluorescentes recombinantes junto con un gen de interés, lo que permite la selección de células sin usar anticuerpos. Después de los pasos de incubación y lavado, se lisan los glóbulos rojos, si se analiza sangre completa. El motivo de la lisis de glóbulos rojos se muestra a continuación:

Sin lisis, los glóbulos rojos abruman al citómetro, ya que constituyen alrededor del 95 % de las células en la sangre entera humana. Los glóbulos blancos (leucocitos), por otro lado, solo constituyen el 0.1-0.2% de las células y los linfocitos entre el 15 y el 50% de los leucocitos.

A continuación, la mezcla de células se analiza en un clasificador de células como BD FACSAria .

^{De: https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Fluorescence_Assisted_Cell_Sorting_%28FACS%29_B.jpg}

Las células pasan en fila india frente a uno o más rayos láser, que excitan los tintes y hacen que emitan fluorescencia a una cierta longitud de onda. Luego, el usuario puede usar la activación para seleccionar la combinación y la intensidad de los colores que le interesan, y cuando una celda cumple con los criterios, recibe una carga eléctrica y los electroimanes la dirigen a un contenedor de recolección.

Entonces, ¿cuáles son los pros y los contras de cada tecnología? La separación MACS generalmente es más rápida que la tinción FACS, y se puede procesar una mayor cantidad de células a la vez (a veces órdenes de magnitud más, según el instrumento y el protocolo). Si, por ejemplo, busca purificar grandes cantidades de células T CD4+ de sangre total, MACS puede ser la mejor opción de las dos (aunque prefiero RosetteSepsistema para ese requerimiento en particular). MACS no requiere un instrumento dedicado bastante costoso, aunque las plataformas automáticas están disponibles si es necesario. En el lado negativo, la mayoría de las cuentas calificadas para MACS solo están disponibles en Miltenyi, por lo que si no tienen cuentas disponibles con su marcador particular de interés, deberá hacer la conjugación usted mismo, a expensas del tiempo y posiblemente del valioso anticuerpo mientras optimizas las condiciones. Los anticuerpos conjugados con fluorescencia son extremadamente comunes y están disponibles en prácticamente innumerables compañías, por lo que, a menos que esté trabajando con un anticuerpo autogenerado, es mucho más probable que pueda encontrar uno para FACS con bastante facilidad. hay _Perlas MACS que contienen anticuerpos dirigidos a ciertos fluoróforos, por lo que puede usar anticuerpos de flujo para MACS, aunque es probable que aún sea necesaria la optimización. Finalmente, la separación MACS es solo una opción para las células que tienen su marcador de interés expresado en la superficie celular.

One of the major advantages of FACS is multicolor staining (depending on the instrument you're using). This makes it much more straightforward to purify potentially rare populations that are only differentiated by their combined expression of a number of surface markers, necessitating multiple gating steps. If this were to be accomplished by MACS, you would need to go through multiple rounds of purification, something that could take longer than FACS, and not necessarily be feasible, as a certain number of cells are required for each MACS run. With FACS, these rare populations (which may only be tens or hundreds of cells per million) can be collected just as easily as more common ones. Also, as mentioned above, there are more antibodies available for flow/FACS than for direct MACS. Additionally, FACS allows for sorting of cells expressing GFP and relatives, letting you collect populations based on internal markers.