Estoy ordenando una línea derivada 293. Una cosa que es preocupante para mí es la viabilidad celular después de la clasificación. Por lo general, he estado tiñendo y lavando a temperatura ambiente (en la mesa de trabajo) en un nutador. He estado leyendo que la mayoría de los procedimientos de clasificación indican que deberías hacerlo a cuatro grados en la oscuridad. Tengo entendido que esto ayuda con la aglutinación, pero ¿es esto a expensas de la viabilidad? ¿El frío provoca la apoptosis de estas células?
Actualmente mi procedimiento es el siguiente:
Usando HBSS + EDTA 1 mM + BSA al 1% (tampón de clasificación), suspendo aproximadamente 10-15 millones de células por ml.
Mancha con primario
Girar a 300 xg durante 5 minutos
Agregue 15 ml de tampón de clasificación, gire nuevamente
Mancha con secundaria en 1 ml de tampón de clasificación
Lavar x2 con 15mL
Cepa
Clasificar
Una cosa que puedo hacer para minimizar la muerte celular es hacer una tinción viva/muerta (acabamos de agregar esa capacidad). La otra cosa que leí fue usar 50% de FBS en su tubo de recolección.
La otra cosa que podría ser motivo de preocupación es que si estamos haciendo muchas clasificaciones, entonces algunos de los tubos pueden permanecer en el búfer de clasificación durante mucho tiempo en la cola. ¿Cuánto tiempo es demasiado?
Por último, usamos puromicina y blasticidina como marcadores de selección para nuestras bibliotecas y, por lo general, los agregamos justo después de cambiar la placa. ¿Deberíamos esperar un rato?
Gracias por el consejo
Tiene varias preguntas, intente limitar sus publicaciones a una pregunta cada una. Dicho esto, intentaré abordar cada una de sus inquietudes.
¿El frío provoca la apoptosis de estas células?
No. El propósito de teñir a 4 °C y lavar con tampón frío es doble: mantener la viabilidad (todos los procesos celulares se ralentizan a temperaturas más bajas) y evitar la internalización del receptor. Este segundo punto es especialmente crítico ya que está usando un primario y un secundario conjugado, que realmente no recomendaría clasificar a menos que sea absolutamente necesario, por ejemplo, si el anticuerpo que está usando no está disponible en un formato directamente conjugado.
Una cosa que puedo hacer para minimizar la muerte celular es hacer una tinción viva/muerta (acabamos de agregar esa capacidad).
Las manchas vivas/muertas generalmente son una buena idea, pero asegúrese de que la mancha que está usando no sea citotóxica. L/D siempre debe ser el último paso de tinción antes de analizar las muestras. Una mejor manera (si su clasificador lo admite) es usar mediciones de altura y área de dispersión frontal (FSC) y dispersión lateral (SSC) para discriminar células individuales de tamaño apropiado, luego seleccionarlas primero antes de seleccionar su tinción de anticuerpos (FITC). o PE o cualquiera que sea tu secundaria).
La otra cosa que leí fue usar 50% de FBS en su tubo de recolección.
No estoy seguro de cuánto ayudará eso, especialmente los 293, que son bastante duros. Solo asegúrese de diluir las células recolectadas lo suficiente en el medio para que el porcentaje de suero vuelva a bajar al 10%.
si estamos haciendo muchas clasificaciones, entonces algunos de los tubos pueden estar sentados en el búfer de clasificación durante mucho tiempo en la cola. ¿Cuánto tiempo es demasiado?
Siempre que sus muestras se mantengan en la oscuridad sobre hielo oa 4 ° C, deberían estar bien durante varias horas al menos (aunque no pasaría la noche). Además, asegúrese de que su medio de recolección esté frío, ya que puede provocar que las células pasen de 4 ° a 37 ° demasiado rápido. Recoja su muestra, colóquela en placas, luego póngala a temperatura ambiente o en la incubadora (dependiendo de su flujo de trabajo) y deje que se caliente de esa manera.
Por último, usamos puromicina y blasticidina como marcadores de selección para nuestras bibliotecas y, por lo general, los agregamos justo después de cambiar la placa. ¿Deberíamos esperar un rato?
No, no te preocupes por eso. Puede esperar si lo desea, o agregarlo de inmediato; me inclinaría por agregarlo más rápido que no, para que no le dé a las células no deseadas ninguna posibilidad de crecer.
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