Análisis de datos de citometría de flujo [cerrado]

Descargo de responsabilidad: se supone que sabe cómo funciona la citometría de flujo.

Ha realizado un ensayo de apoptosis de AnnexinV basado en el flujo aquí.

La proteína Anexina A5 (Anexina V) se une a la fosfatidilserina (PS), que normalmente se encuentra en abundancia en la hoja interna de las células vivas. Tras el inicio de la apoptosis, se sabe que la PS cambia a la hoja externa. Por lo tanto, puede usar la anexina V conjugada con una molécula fluorescente como el isotiocianato de fluoresceína (FITC) para observar la PS externalizada.

La 7-aminoactinomicina D o 7-AAD es un intercalador fluorescente que se puede usar para detectar ADN y se excita en el láser de 488 nm (se emite en un filtro de paso largo de 650 nm o similar). El tinte no es permeable para las células vivas, por lo que para las células muertas o moribundas con permeabilidad de membrana comprometida, se une libremente al ADN.

El problema con cualquiera de los dos solos es que no puede decir que una célula 7-AAD+ es apoptótica y no puede decir que una célula anexina V+ es apoptótica, porque sabemos que tiene apoptosis temprana y apoptosis tardía, y en cualquiera de los dos la célula no está completamente muerta, todavía . También tienes necrosis.

Y así, en un diagrama de puntos de 7-AAD y Anexina V, puedes crear 4 cuadrantes basados ​​en el mecanismo de los dos componentes:

Double-negative: No external PS or DNA binding means these are viable cells.
Double-positive: Both external PS and membrane instability means late apoptosis.
AnnexinV single-positive: Undergoing early apoptosis, nucleus isn't yet permeable.
7-AAD single-positive: Completely dead or necrotic, membranes have probably disintegrated.

La base del ensayo es que está tratando de determinar en qué etapa de muerte celular se encuentran sus células.

El control sin teñir es una forma de observar solo sus células y le permite corregir la autoflorescencia , la fluorescencia generada por sus células solo a partir de la excitación. También desea ejecutar controles de una sola mancha para ver dónde se encuentran sus poblaciones positivas y negativas. Sin controles FMO (fluorescencia menos uno, básicamente su panel de tinción completo menos un color), es difícil decir con seguridad dónde se delinean los aspectos positivos y negativos durante la activación, debido a los efectos del desbordamiento y el ruido.

Una nota sobre el control de tinción única de Anexina V: puede ver que en la muestra sin tratar, básicamente no hay Anexina V, pero en el control es el 22,0 % de las células. Los controles de tinción única en los que se supone que existen positivos deben tener positivos y negativos. Sin aspectos positivos, ¿dónde pones la puerta para ellos? ¿Qué pasa si la población cambia durante la adquisición? Probablemente usaron células que estaban muriendo a propósito para generar controles confiables para esa muestra.

Esa es la mitad izquierda de sus datos . La mitad derecha son tratamientos . Básicamente, ha teñido las células para ambos marcadores y luego las ha tratado con Torin2, rapamicina y mitomicina para ver cómo esos compuestos afectan la viabilidad de las células. Hay un control donde no agregaste nada.

En función de las puertas establecidas con los controles, puede ver que la muestra de mitomicina tiene el mayor efecto: las células son 6,54 % positivas para anexina V, experimentando apoptosis temprana, y 14,3 % son doblemente positivas, experimentando apoptosis tardía, y 8,09 % están muertas o necrótico.

La conclusión que derivaría es que la mitomicina, pero no los otros compuestos, tiene un efecto profundo en la viabilidad de las células.