Por lo general, tomo 0,8 ml de mi muestra de proteína y 0,2 ml de tampón de muestra (2X) para la preparación de mi muestra en SDS PAGE. ¿Estoy usando la proporción correcta? la concentración de mi muestra de proteína es de 4,1 mg/ml. ¿Cuál es el protocolo estándar?
La preparación de muestras para geles de proteínas no es una tarea compleja. Simplemente mezcle la cantidad adecuada de tampón de muestra con su muestra y cárguela. Para un tampón de muestra 2x, use cantidades iguales de muestra y tampón, para un tampón de muestra 5x, use 4 partes de muestra y 1 parte de tampón (por ejemplo, 40 µl + 10 µl). Caliente las muestras mezcladas durante 5 minutos a 95 °C, enfríelas inmediatamente en hielo y cargue una cantidad adecuada en el gel. La cantidad que es posible realmente depende del tipo de gel que use; por lo general, debería ser posible entre 20 y 30 µl.
No cargue demasiada proteína, de lo contrario no podrá separarlas adecuadamente. Usualmente uso entre 20-30 µg de proteína total por pozo o tan solo 50 ng para proteínas purificadas (esto también depende de los anticuerpos).
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Para los tampones de muestra, suelo usar las siguientes recetas. Prefiero el 5x, porque puedo cargar más proteína, si la preparación no es muy buena. También prefiero el uso de TDT al Mercaptoetanol, ya que huele mucho menos. Si no tiene DTT (o prefiere mercaptoetanol), puede reemplazarlo por una cantidad igual (200 mM en el tampón 2x, 500 mM en el tampón 5x). Si usa DTT, debe hacer alícuotas del tampón y almacenarlo a -20 °C, una alícuota de trabajo se puede mantener a 4 °C durante dos semanas más o menos.
Tampón de muestra 2x:
Tampón de muestra 5x
cris
kt123
cris
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