Algoritmo de normalización de PCR en tiempo real

Al realizar la normalización de los resultados de PCR en tiempo real, encontré dos formas de hacerlo:

  1. En mi laboratorio siguen el siguiente diseño: Eficiencia − ( C T   gen de interés − C T  limpieza interna ) cada vez controles con controles y tratamientos con tratamientos. Luego dividen todos los valores (tratados y controles) cada uno con controles.

  2. Por otro lado encontré otra forma de normalizar que sigue estos pasos: Eficiencia ( C T control − C T tratado ) . Luego haces lo mismo para el gen normalizador y divides el primero por el último.

Los valores obtenidos son similares pero no exactos. También noté que el primer algoritmo da valores bastante diferentes para la mayoría de las diluciones al realizar una curva estándar. ¿Cual es correcta?

Para aquellos que no están satisfechos con 2 Δ ( Δ C t ) y desea incorporar diferentes eficiencias de las reacciones de PCR objetivo y normalizador, ¿funcionaría esta fórmula para calcular valores arbitrarios para la expresión relativa?
Eficiencia t a r gramo mi t − ( C t objetivo ) Eficiencia norte o r metro a yo i z mi r − ( C t normalizador )
He comparado los resultados con los del propio software del instrumento RTPCR usando calibradores de un grupo de muestras probadas y encajan casi perfectamente. Pero, ¿es válida la ecuación en un sentido teórico?

Respuestas (2)

El primer paso es el cálculo de la eficiencia, denotado por digamos mi gramo mi norte mi . Vea esta publicación para el cálculo de la eficiencia de la imprimación.

Entonces, el cambio de pliegue para ese gen se calculará mediante mi gramo mi norte mi − Δ C t gramo mi norte mi

Dónde:

Δ C t = C t t r mi a t mi d − C t C o norte t r o yo

Pero estos valores de Ct no están normalizados. Para la normalización, toma algún gen de referencia que no necesita ser un gen de mantenimiento. El gen de referencia debe elegirse de manera que no se vea afectado por el tratamiento. En algunos casos, los genes domésticos habituales también pueden verse afectados, por ejemplo, en tratamientos que afectan el ciclo celular o la diferenciación. En tales casos, debe usar un suplemento (un ARN artificial que se parece poco a cualquier gen conocido).

Puede normalizar el cambio de pliegue ( Caso A ) o encontrar el cambio de pliegue de la expresión normalizada ( Caso B ).

Significa lo mismo matemáticamente.

Caso A :

mi gramo mi norte mi − Δ C t gramo mi norte mi / mi r mi F − Δ C t r mi F

Caso B :

[ mi gramo mi norte mi − C t gramo mi norte mi t r mi a t mi d ] / [ mi r mi F − C t r mi F t r mi a t mi d ] [ mi gramo mi norte mi − C t gramo mi norte mi C o norte t r o yo ] / [ mi r mi F − C t r mi F C o norte t r o yo ]

Puede reorganizar el numerador y el denominador para obtener el Caso A del Caso B. No estoy seguro de cómo terminas obteniendo valores diferentes. Vuelva a comprobar una vez. Puede deberse a errores de aproximación numérica .

El caso A se ve mucho más ordenado; así que es mejor calcular de esa manera :)

perdón por la molestia pero me equivoqué en la consulta, mi punto 1 está editado
La respuesta aún se mantiene :) El Caso B es lo que sigue su personal de laboratorio (punto 1) y el Caso A es el punto 2 de su pregunta
Nota: no puedes juntar las fracciones en el numerador para obtener el pags o i norte t   1 tipo de forma porque las bases no son iguales ( mi gramo mi norte mi   v s     mi r mi F ). Solo se puede hacer si las eficiencias son las mismas.

Este tema probablemente podría tener su propio StackExchange, hay mucha información y pruebas y errores realizados con rtPCR. Aquí están mis 2 centavos:

Su cálculo ajustado no normaliza sus datos, simplemente resta el 'fondo' o control. Para estudios de expresión esto no es suficiente. La normalización de los datos para la expresión génica debe implicar establecerlos en una escala de otro gen cuya expresión no solo debe estar presente sino ser consistente entre sus muestras tratadas y no tratadas. Los genes domésticos (probablemente esté usando GAPDH) son buenos candidatos para esto porque su expresión rara vezcambios. Si no normaliza, entonces no sabe si su expresión realmente está cambiando, o si simplemente se debe a una mayor entrada de ARNm. Sin embargo, debe demostrarse que la expresión del gen de limpieza tampoco cambia, esto generalmente se logra utilizando un conjunto de muestras diferente. Tome si de mí, he hecho mucho de esto y este paso es uno de los más importantes en su experimento. Cualquier revisor que sepa lo que está haciendo rechazará un artículo usando rtPCR sin las estadísticas adecuadas.

He tenido mucho éxito al usar el software StepOne de Applied Biosystems para proporcionarle valores de Ct precisos. Generar la variable es una complicación, use software para hacerlo bien cada vez:

http://www3.appliedbiosystems.com/cms/groups/mcb_support/documents/generaldocuments/cms_042380.pdf

¿Qué método/sistema estás usando?

Ha habido varios casos en los que GAPDH no es adecuado como gen de referencia.
SYB Green y roche, acerca de la normalización no tiene ni idea realmente
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