Cada vez que se realiza una PCR, tenemos que usar genes de limpieza como GAPDH, para autonormalizar los valores para tener en cuenta los diferentes ADNc/ADN iniciales. Ahora hay muchos genes diferentes como GAPDH, ubiquitina, actina, etc.
Ahora, cuando se trata de células, puedo entender que debido a su naturaleza inmortal y el número francamente impactante de generaciones que han sufrido, la expresión del gen de limpieza puede cambiar.
Suponiendo que no estoy tratando con células sino con tejidos animales, ¿importa qué gen doméstico selecciono? O, en otras palabras, ¿GAPDH me dará la misma consistencia entre las muestras que algo así como el ARN ribosomal 18s o me estoy perdiendo algo específico?
Sí, sí importa. La expresión génica varía mucho en los tejidos y las condiciones de vida, por lo que debe probar una variedad de genes y elegir los que tengan la menor variación en la expresión entre la muestra y el control.
Si no encuentra ninguno, debe probar otros genes para este propósito. Esto es importante, ya que puede afectar gravemente el resultado de su experimento, ya que normaliza los genes de limpieza. Si estos no son constantes, causará problemas. Echa un vistazo a las referencias, esto me ayudó mucho.
Referencias:
Sin embargo, debes tener cuidado. Algunos genes muy utilizados podrían ser muy poco informativos como genes domésticos en qPCR. ACTB y GAPDH tienen toneladas de pseudogenes (genes análogos que no producen proteínas) que pueden interferir con la PCR. Puedes leer más en este artículo (1).
Para empeorar las cosas, los fragmentos de amplificación de PCR pueden tener exactamente la misma longitud que el amplicón de ACTB, lo que hace que sea imposible diferenciarlos.
Además, debe tener en cuenta el tipo de célula, la aplicación o el tratamiento específicos, ya que algunos ARNm pueden ser muy constantes durante el tratamiento A en la célula de tipo 1, pero varían con el tratamiento B o en la célula de tipo 2.
Creo que lo mejor sería usar múltiples tareas de limpieza (3-5) y ver cómo se comportan entre sí. También podría utilizar la media de estos servicios de limpieza.
(1) Sun, Yuan, et al. "Pseudogenes como debilidades de ACTB (Actb) y GAPDH (Gapdh) utilizados como genes de referencia en la transcripción inversa y reacciones en cadena de la polimerasa". PloS uno 7.8 (2012): e41659.